普通转录组虽能解析基因的表达信息，但却好比将细胞打碎后拼凑的"碎片"，缺少了细胞间的空间位置信息使其对于分子机制的解析能力存在局限。空间转录组技术不仅能捕捉基因表达的动态图谱，更能精准锁定细胞在三维组织中的空间坐标，揭示肿瘤侵袭前沿的异质性、组织发育中的微环境互作网络，真正让细胞过程从模糊的"草图"升级为高清的"实景地图"。

样本设计与处理是空间转录组研究的基础。合理的样本采集、处理能最大限度保留转录本的完整性和空间信息，提供有意义的生物学信息，从而回答特定的生物学问题。今天我们根据各位老师对于空间转录组的常见问题整理了一系列与样本处理相关的Q&A，如果各位在进行空间转录组时，不知道如何处理样本设计，不妨看看下面的回答是否可以帮助到你。

Q1

植物组织样本如何进行空间转录组？

只要是不基于探针的空间转录组技术，植物组织样本都可以进行空间转录组测序。对植物组织进行空间转录组测序，一般不推荐使用成熟组织样本，主要有两方面的原因。

第一，成熟植物组织的细胞排列较为稀疏，并且液泡较为发达，细胞后含物丰富。因切片中真正能够被空转芯片上的spot捕获到的转录本信息较少，不利于后续数据分析。

第二，成熟的植物组织的木质化水平较高，导致细胞中的转录本释放较为困难，部分成熟植物组织具有大量导管和筛管，这类组织内的转录本丰度较低，因此无法提供有意义的生物学信息。

图1：成熟植物组织

相比起成熟植物组织，新生组织的细胞密度高、细胞壁较薄、代谢活性高，更易于组织固定和转录本保存，减少样本处理中的RNA降解风险，所以如果做植物的空间转录组的话，更推荐使用新生组织样本。

Q2

骨组织样本如何进行空间转录组？

骨组织是一种包含细胞、胶原纤维、金属离子的特殊的结缔组织，如果要进行空间转录组测序存在较大困难，原因有以下两点。

1、空间转录组本质是要获得细胞内的转录本信息，而骨组织中的细胞被镶嵌在骨基质中，钙离子作为骨基质中的主要无机离子，其存在会影响RNA释放以及HE染色，因此在进行测序实验前对骨组织脱钙，而脱钙过程中需要长时间将骨组织浸泡在脱钙剂中，也可能会导致RNA被降解。

2、骨组织中的骨谱系相关细胞被覆盖在骨基质中，其细胞密度较低，因此能够真正被单个spot覆盖的细胞数较少，能捕获到的RNA量也会相应降低。

以上两点使得骨样本最终获得的数据质量很差，在spot中仅有很低的UMI检测量，不具备继续使用的条件。

虽然骨组织的处理存在诸多困难，但目前已经有成功经验。2025年1月，Neashan Mathavan等人就成功对小鼠的股骨进行了基于FFPE的10X Visium空间转录组测序[1]。研究团队首先将小鼠股骨浸泡在福尔马林中16-24小时，之后把股骨浸泡在4℃的EDTA中脱钙10天，最后使用石蜡包埋样本。完成以上步骤之后选取DV200值>50%的样本切片进行空间转录组测序。

图2：骨切片HE染色图

图3：股骨切片中的基因表达spot分布图

Q3

肿瘤样本如何设计对照组和实验组？

空间转录组对肿瘤微环境的解析能力为更进一步了解肿瘤的发展、免疫机制提供了良好的契机。而空间转录组的性质使得其实验设计较其他组学也有所不同。根据研究目的的不同，我们可以采用不同的取样方式。

（1）研究肿瘤微环境的景观变化

这种方法可以只取位于肿瘤与正常组织交界处的样本，可以同时获得癌与癌旁的组织，检测肿瘤发生病变或增殖时有哪些特异性高表达或低表达的基因，通过对这些基因进行富集分析以及GSVA分析等挖掘肿瘤的发病机制以及肿瘤微环境的景观变化。

图4 同时包含肿瘤与肿瘤邻近正常组织的切片图[2]

（2）研究免疫、肿瘤微环境景观差异

如肿瘤组织较大，不方便同时获取癌与癌旁的组织块，又想研究免疫、肿瘤微环境变化的话，可以分别选取三组样本：肿瘤中心、肿瘤边界以及临近正常组织。这样既可以研究肿瘤组织与正常对照组织间的微环境变化，还可以通过比对肿瘤边界的组织微环境变化去探究肿瘤的发病机制与关键的治疗靶点等。

图5：针对肿瘤中心、肿瘤边界和邻近组织的研究框架[3]

（3）研究肿瘤的异质性。

做空间转录组测序时可能会出现一种特殊情况，像人的皮肤样本，正常组织比较难透化，而发生癌变后，组织的微环境发生了变化，能透化出RNA，就能检测到基因表达。像这种正常组织难以得到空间转录组数据的，可以选择进行单细胞转录组测序，随后对病变的样本进行空间转录组测序，将两个组学的数据结合对于研究肿瘤内或肿瘤间的异质性是一种可行的实验设计方案。

图6：正常组织单细胞转录组测序结合病变组织空间转录组测序的研究框架[4]

Q4

空间转录组需要几个生物学重复？

目前做空间转录组测序是可以不做生物学重复的，主要涉及以下原因。

1、生物学重复需基于不同个体的样本，但组织内部的空间异质性（如肿瘤核心与边缘的基因表达差异）可能导致同一组织不同切片的差异掩盖真实的生物学差异。

2、技术重复与生物学重复易混淆，对同一组织连续切片属于技术重复，仅能评估实验操作误差，无法反映个体间差异。

3、作为实验难度大、成本较高的新兴技术，空间转录组初期通常不强制要求生物学重复，但需通过多区域采样、单细胞数据联合分析或独立实验验证提升结果可靠性。

考虑以上原因，如果是细胞分布均匀的组织（如肝脏），或能精确匹配切片位置（如特定脑区），可尝试设置生物学重复。

图7：小鼠胚胎的连续矢状切面样本的组织分布存在差别[5]

Q5

大型的OCT/FFPE包埋块如何取样？

如果研究的样本组织太大而无法放入单个捕获区域，则可对组织进行切分并对切分后的组织进行切片并放置在捕获芯片的不同捕获区域上。每个捕获区域都可以获得组织切片不同部分的空间信息，在后续的分析中可以将其合并。

以小鼠大脑OCT包埋块为例，如果要进行切分，可以中线为轴做矢状切片，将大脑OCT包埋块分为左右两个包含脑半球的区域再进行切片，使半球的一侧或两侧可以放置在捕获区域上。建议在实际操作之前可以使用空白的OCT包埋块进行测试以保证成功率。

图8：大型OCT包埋块组织进行切分适配捕获区域示意

参考文献

[1] Mathavan N., Singh A., Marques F.C., et al. Spatial tranomics in bone mechanomics: Exploring the mechanoregulation of fracture healing in the era of spatial omics [J]. Sci Adv, 2025, 11(1): eadp8496.

[2] Hunter M.V., Moncada R., Weiss J.M., et al. Spatially resolved tranomics reveals the architecture of the tumor-microenvironment interface [J]. Nat Commun, 2021, 12(1): 6278.

[3] Andrieux G., Das T., Griffin M., et al. Spatially resolved tranomic profiles reveal unique defining molecular features of infiltrative 5ALA-metabolizing cells associated with glioblastoma recurrence [J]. Genome Med, 2023, 15(1): 48.

[4] Ji A.L., Rubin A.J., Thrane K., et al. Multimodal Analysis of Composition and Spatial Architecture in Human Squamous Cell Carcinoma [J]. Cell, 2020, 182(2): 497-514 e22.

[5] Srivatsan S.R., Regier M.C., Barkan E., et al. Embryo-scale, single-cell spatial tranomics [J]. Science, 2021, 373(6550): 111-7.