1.1.1 实验对象

招募68名在校非体育专业大学生为研究对象，所有研究对象对实验内容知情同意，均完成了运动风险筛查问卷调查、体力活动问卷、身体活动危险性检查表、膳食调查问卷。实验得到伦理道德委员会批准。

1.1.2 筛选标准

无规律运动，无严重传染病史，无肢体缺陷，无精神疾病，无严重器质性病变，至少一个月内未使用抗生素和抗腹泻药物。

1.1.3 志愿者基本信息

68位志愿者完成了为期12周的高强度间歇性训练，其中男生28人，女生40人，见。

1.3.1 运动干预方案

运动干预采用为期12周，每周3次每次28 min的高强度间歇性训练方案^[]，分适应和提高2个阶段。适应阶段(1-4周)：第1周受试者进行56组× 15 s间歇跑(在28 min的训练时间里进行15 s跑走交替的间歇训练)，即受试者先进行15 s强度为90%-95% HRmax [心率大约为(180-190)±5 bpm]的跑步后，再进行15 s强度为70% HRmax (心率大约为140±6 bpm)的快走间歇，共计56组；第2周调整为28 min的30 s跑走交替的间歇训练；第3周调整为28 min的1 min跑走交替的间歇训练；第4周调整为28 min的2 min跑走交替的间歇训练。提高阶段(5-12周)：进行4组×4 min间歇跑，即受试者先进行4 min强度为90%-95% HRmax [心率大约为(180-190)±5 bpm]的跑步后，再进行3 min强度为70% HRmax (140±6 bpm)的慢跑间歇，共计4组。每次训练开始前受试者先在操场进行10 min慢跑热身，热身结束后开始正式训练。每次训练结束后受试者进行3 min慢跑的积极休息，心率控制在70% HRmax (心率大约为140±6 bpm)。

受试者最大心率HRmax=196.86-0.74×年龄^[]。为受试者佩戴Polar表对训练过程进行心率实时监测，确保训练的安全性和有效性。

1.3.2 粪便DNA提取和16S rRNA基因扩增子测序

事先对研究人员和受试者进行相关培训并告知注意事项，志愿者在运动前后使用采样器各采集一次新鲜粪便样本，做好标记常温保存。采用SDS裂解液冻融法通过PowerMax试剂盒提取粪便总DNA，在-20 ℃储存。采用NanoDrop 2000C分光光度计测定DNA的数量和质量。

16S rRNA基因作为可以对细菌进行种属鉴定的序列，包括10个保守区域和9个高变区域，高变区域可以体现细菌间的差异。本研究选择V4变异区的正向引物515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCG GTAA-3′)和反向引物806R (5′-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′)进行PCR扩增。PCR反应体系(50 μL)：Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer 25 μL，515F和806R引物(10 μmol/L)各3 μL，DNA模板10 μL，DMSO 3 μL，ddH₂O 6 μL。PCR反应条件：98 ℃ 30 s；98 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，25个循环；72 ℃ 1 min。得到的PCR扩增产物用Agencourt AMPure XP 60 mL Kit纯化，并使用Qubit dsDNA HS Assay Kit进行量化，最后使用Illlumina HiSeq 4000双末端(Pair-End) 2×150 bp平台进行测序。

1.3.3 高通量测序数据处理及生物信息学分析

根据Barcode序列和引物序列把下机数据拆分为各个样本的数据。截去Barcode和引物序列后，使用VSEARCH V2.4.4对每个样品的Reads进行拼接，得到原始Tags数据(Raw Tags)。在此基础上对序列质量进行质控、过滤、去除嵌合体序列，得到有效数据，以97%的相似度进行OTU聚类和物种注释。根据聚类结果，使用QIIME和R软件，基于R包“Venn Diagram”生成韦恩图，比较不同组之间共有和特有的OTU数目；基于QIIME计算α多样性的值，采用R中的t test函数和Ape包进行组间香农-威纳指数(Shannon指数)比较并绘制主坐标分析(Principal Co-Ordinates Analysis，PCoA)图，对运动前后微生物群落结构进行显著性分析；不同分类水平的组间物种构成丰度图使用R包Barplot函数；组间差异物种使用LEfSe默认设置进行各组间分类单位上的检测。

1.3.4 统计学分析

使用SPSS 19.0软件对数据进行差异性分析。符合正态分布的数据，描述采用均值±标准差表示，不符合正态分布的数据则采用M (P25，P75)表示；运动前后指标采用秩和检验或配对样本t检验。

2.1.1 运动前后肠道菌群物种组成丰度分析

对136个样本进行测序，统计运动前后OTU数目以及分析运动前后2组的优势菌，Venn图可以展示不同组之间共有和差异OTU数目。由可知，运动前OTU数目为2 836，运动后数目为5 888，共有数目为2 436，运动后OTU数目明显增加，提示运动可以提高物种丰富度。显示运动前后各水平上优势菌是一样的，主要都由拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门组成，这提示运动不会对肠道菌群整体大结构产生影响，但是运动后拟杆菌门丰度提高，厚壁菌门和变形菌门的丰度降低，说明运动对肠道菌群具有调节作用，这与Morita等^[]的研究结果一致。为了了解组间及属水平上的群落构成相似性，选取丰度排名前30的属进行聚类分析，如所示，在属水平上运动前后肠道菌群的物种丰度差异较大，需要对运动前后2组样本进一步分析。

2.1.2 运动前后肠道菌群多样性分析

人体内微生物的多样性可以用其丰富度和均匀度来描述，即α多样性和β多样性，有研究表明物种多样性与表型健康呈正相关^[]。为分析运动前后OTU组成的差异，本研究进行了香农-威纳指数和主坐标分析。Shannon指数综合考虑了群落的丰富度和均匀度，通过对运动前后Shannon指数进行t检验发现，如所示，运动后肠道菌群多样性提高。是基于距离矩阵构建的PCoA，根据运动前后2组样本在二维坐标的距离远近反映样本组成结构的相似性，可知运动前后2组样本之间有明显区分。这提示运动前后肠道菌群的OTU组成差异比较大。

2.1.3 运动前后肠道菌群的差异物种

为了探索运动前后的差异物种，对运动前后物种进行LEfSe分析，中不同颜色代表不同组之间的显著差异物种，其中显著差异的Logarithmic LDA Score设为2，值越大差异越显著，结果如所示，运动前后在科、目、属水平上均存在显著差异的物种，运动前属水平上Faecalibacterium、Unclassified-f-Enterobacteriaceae、Lactobacillus、Unclassified-f-Pasteurellaceae、Acinetobacter和目水平上Enterobacteriales、Pseudomonadales及科水平上Enterobacteriaceae、Lactobacillaceae、Moraxellaceae丰度显著高于运动后；运动后属水平上Ruminococcaceae-UCG-014、Eubacterium-ruminantium-group、Lachnospiraceae- UCG-010、Tyzzerella-3、Unclassified-o-Bacteroidales和科水平上Unclassified-o-Bacteroidales的丰度显著提高。以往有研究报道，运动后显著增加的Ruminococcaceae-UCG-014与焦虑症呈负相关^[]，Lachnospiraceae能产生对人体有益的丁酸类物质从而降低结肠癌的患病几率^[]。运动能调节肠道菌群结构，提示或许可以通过运动改善肠道菌群引起的相关疾病。

致谢:
特别感谢杭州谷禾信息技术有限公司所有工作人员在肠道微生物测序及分析上所做的重要工作。