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在一个月黑风高，凌晨两点的夜晚，忙得不可开交的你，正准备审核完最后一个生化报告去休息室打个盹。然而，当你看到高大上的生化仪传过来的结果时，砸仪器的心都有了。什么鬼？负值！于是，你不得不打起精神，重做一次。运气好的话，半个小时能把报告发出去，运气不好的话，嘿嘿嘿…… 那么，这个负值到底是怎么来的呢？

下面，我来试着解释下生化项目负值的结果是怎么来的，为什么会出现负值。

上图是两点终点法的浓度计算公式，其中定标液1一般是0浓度，斜率和截距仪器默认一般是1和0（参数设置界面有可能做过更改，不是1和0）。那么负值就自然就来自于前半部分的K（A_x-A_b）。

1、Ab：即S1 Abs，就是我们通常说的试剂空白，不管是常规标本，定标还是质控测试的结果都会减去试剂空白。

2、Ax：也就是参数界面设置的两点间吸光度的差值，具体计算方式如下图（注意并不是简单的将两点的吸光度相减，并且考虑了加入R2之后的稀释效应）

3、K：我们一般说的K值或K因数，定标之后得到或者手动输入的，计算公式如下图：

其中A₂的计算方式与上面提到的A_x相同，S1 Abs即试剂空白。

以上三者都可能是负数，都与吸光度有关，所以凡是会造成吸光度不正常变化的因数都有可能造成负值的结果。

一些影响结果的主要原因

1、灯泡老化或质量问题：部分生化分析仪是要求吸光度>19000或750小时需要更换。

2、反应杯脏或者损坏：部分生化分析仪是要求与1号反应杯的吸光度差值＜±800。

3、清洗针堵塞或者漏气：反应液无法抽走或者无法添加清洗液进行清洗；也有的可能会在测试中滴水，反应液被稀释，造成吸光度突然下降，可能出现负值。

4、搅拌棒清洗不干净：搅拌棒有一层特氟龙涂层，如果被刮坏，不易洗干净，易造成交叉污染。

5、样品针堵塞：样品没有被加入到反应杯，没有发生反应，反应曲线是一条直线，吸光度没有变化，差值为负，出现负值。

6、试剂R1/R2添加错误：很多实验室应该都是习惯于在试剂快用完了时，往试剂瓶里面添加试剂的做法，部分生化分析仪加样顺序是：样本S+试剂R1+试剂R2，因为主要反应物在R2，如果放反了，样本S和试剂R2直接就开始反应，吸光度上升，等试剂R1加入后吸光度下降，吸光度差值为负，结果出现负值。

7、严重脂血或黄疸标本：加入样品S+R1时吸光度就很高，加入R2之后反应的吸光度可能还没有S+R1高，吸光度差值为负，结果出现负值。

8、长时间未定标或未做试剂空白：试剂使用时间太长被污染或变质，试剂空白吸光度升高很多，等到你下次更换一瓶新试剂的时候，未定标或未做试剂空白，使用的还是被污染之后的定标和试剂空白结果，可能出现负值（见过超过一年没有定标，没有做试剂空白的）。

9、底物耗尽：通俗的讲就是，浓度太高，试剂里面的反应物不够用了，造成吸光度异常下降或上升。一般酶类项目会出现这样的情况，可采取稀释重做。

如果你说上面又是公式又是反应曲线的，

太复杂了，

我都不懂咋办？

那么你可以考虑试试采取以下方式处理

1、查看标本是否脂血，如果是严重脂血标本试试高速离心后再检测或让患者清淡饮食几天后再抽血检测。

2、检查试剂瓶R1/R2有没有放反。

3、考虑试剂R1/R2添加错误，实际操作中这种情况可能性较大，可将R1/R2整瓶更换之后重新测试看看（反应曲线会有所表现，如果不会看的话直接换掉试试，注意是连瓶子一起换掉！）。

4、如果是酶类项目或者速率法的项目出现负值或异常偏低的情况，考虑底物耗尽，可稀释重测（反应曲线也可以看得出来）。

5、试剂连带瓶子一起换掉，重新定标、做试剂空白，做质控再测标本（一般来讲，可解决相当大的一部分结果问题，也比较容易操作）。

6、特别说下总胆红素和直接胆红素，这两个可能是负值出现频率较高的项目，因为他们反应的吸光度变化比较小，一般也就几百的吸光度变化。

除了要注意样本、定标品、质控品的避光以及试剂空白之外，建议定标的时候增加一个0浓度，也就是采用两点定标，一般采用的是单点定标，默认0浓度的时候吸光度为0通过原点，但有时候其实不是的，对胆红素这种反应度比较低的项目还是有影响的。

部分生化分析仪的原装胆红素试剂，结果应该会比较好一些，专门设置了通道测定样本的吸光度，反应的吸光度会减掉样本的吸光度再进行计算。

7、拿起你手中的电话，骚扰负责你们仪器或试剂的厂家工程师，哈哈……

实战案例分析

某日审核患者结果时发现，LP(a)结果出现较多负值，依据过往经验，首先排除标本因素，如标本量过少，血清中有气泡或纤维蛋白原，标本严重脂血等，然而发现这些标本没有这些问题。

进一步分析，查看AU5831检测结果为负值的标本，调取反应曲线，如图1，图2，正常反应曲线如图3。

图1

图2

图3

LP（a）检测方法为两点终点法，反应监测12,27两点吸光度，与正常反应曲线对照，可见结果异常的曲线中，加入试剂2（R2）后吸光度出现不稳定的变化，可出现1-2个小峰，当反应达到平衡，27点的吸光度值若小于12点吸光度值，则检测结果可出现负值，由此考虑反应体系中是否存在干扰因素。

如我们此前案例报道的，因日常工作中常需检测肾内血透患者标本，此类血液标本离体后的凝集过程较缓慢，需几十分钟甚至更长的时间，常表现为反复离心反复血清凝集的现象，故检测过程中较易产生凝块，长期积累有时可粘附杯壁，较难清洗，且易堵塞清洗比色系统的抽取废液的探针或管路。

另一方面，生化管中存在分离胶，离心不当有时可造成溶胶，凝胶亦可粘附杯壁及造成抽取废液的探针或管路堵塞。遂首先观察比色杯是否异常，查看检测结果为负值的LP（a）所使用的比色杯，比较同一比色杯检测的不同项目是否出现相同的曲线异常，如图4，图5，图6。

图4

图5

图6

如上图，通过比较可见，同样使用201号比色杯，LP（a）曲线异常，而ALP和CHO曲线正常，其他比色杯亦只有LP（a）检测异常，由此可排除比色杯因素造成检测结果为负值。

既然不是比色杯异常影响比色，则进一步分析考虑是否为光源不稳定产生干扰。LP（a）检测为单波长，所用波长为600nm，故重点观察600nm附近检测波长的项目，通过比较可知，TG（如图5），主波长为660nm，CHO（如图6），主波长为540nm，两者反应曲线平滑，且其他波长（如340nm等）处的检测项目均未见异常，由此排除光源不稳定造成的检测结果为负值。

排除以上标本及仪器因素的干扰，明确仅有LP（a）一个项目结果异常后，接下来则考虑试剂因素。从异常的反应曲线可见，试剂1加入后曲线无异常，而加入R2后，吸光度出现不稳定变化，故推测干扰来自R2试剂，疑R2试剂被污染，于是将R2试剂全部更换，随后进行校准，质控，室内质控结果在控，反应曲线如图7。

图7

更换试剂后，将检测结果异常的标本重新检测，反应曲线恢复正常，结果为正值。

生化检验中项目的检测干扰因素众多，当检测结果出现异常时，如何对问题进行分析处理是每个生化检验人员应具备的能力。反应曲线作为生化反应过程的直观反映，当遇到问题时，我们可以通过分析曲线，查找检测过程中误差、失控产生的原因，从而有针对性地找到解决问题的方法，使仪器尽快恢复正常工作。

【参考文献】

[1].D_P_Module-Photometric_Principles,COBI-CD • Version 2.0,Roche diagnostics

[2].D_P_Module-Photometric_Calibration, COBI-CD • Version 2.0,Roche diagnostics

来源：临床检验医学，文章仅作分享，如有侵权请联系我们！

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