细胞房的使用及操作制度一、操作人员制度1.新进细胞房操作前，必须首先了解细胞培养的基本要求，进行必要的培训。

培训考核合格后授予其细胞室使用权限。

2.为保持无菌室清洁，进入无菌室必须在缓冲间更换专用拖鞋、工作服、戴好帽子和口罩。

3.进入细胞间后随手关门。

缓冲间拉门与无菌室拉门不能同时开放，否则失去缓冲间作用。

4.无菌室室内禁止不带口罩开口说话，禁止大声喧哗。

5.专用工作服、拖鞋禁止在室外穿用，定期清洗并消毒，请勿将其带出无菌室。

6.个人配制的试剂需标明试剂名称、配制日期及配置人，冰箱内试剂摆放位置都要固定化，并作好标记。

禁止交叉乱用，乱放，造成可能的污染扩大，所有人员未经本人许可不得使用他人的物品和位置。

7.个人用灭菌物品必需注明消毒人、物品名称、消毒日期。

灭菌后物品放在指定位置，高压灭菌物品可存放7-14天，过期不能再用，需重新包装灭菌。

二、无菌操作1.实验人员的无菌准备1)实验前应用肥皂洗手。

2)更换专用拖鞋、工作服、戴好帽子和口罩。

3)75%酒精消毒手掌、手背。

2.操作台中的无菌操作(此处为操作考核中需要注意的要点内容)1)生物安全柜使用前用经紫外照射灭菌30分钟，实验人员打开通风在通风条件下进行实验操作。

2)在通风条件下，先点燃酒精灯（点燃酒精灯前需检查瓶中酒精是否足够，液面应占瓶高1/3-2/3），再用酒精棉擦拭超净台桌面（尽可能的大于自己所用台面），同时保持工作区域的宽敞。

注：消毒用75%的酒精，酒精灯用95%以上的酒精，向喷壶或灯内添加酒精时请留意。

3)超净台虽经紫外照射除菌，但操作时仍应靠近酒精灯火焰。

4)操作时应尽量减少手臂的运动，尽可能避免左右手交叉（近手操作）：把需要有用的工具和试剂尽可能放在手边，以酒精灯为界，左手用的东西放在酒精灯的左边，右手用的东西放在右边。

例如，一个右手操作者要从试剂瓶里吸取液体，则移液枪应放在右手，而枪头与试剂瓶都应放在左手边。

5)带入操作台中的物品，应注意：经高压灭菌烘干的物品以及各种装培养基、缓冲盐等的瓶子、试管架、胶塞等应先用75%酒精擦拭或喷洒后再放入超净台。

进入操作台操作前的手掌手背以及将要放入培养箱的培养瓶，培养板和培养皿都应用喷洒75%酒精。

6)要养成用镊子操作的习惯：拿取饭盒中的各类物品，尽可能用镊子去夹取；对于小的物品，如瓶盖、枪头、EP管，应避免用手直接去拿取。

7)保持试剂瓶与桌面成约45℃时打开盖子或移取液体：这样可以尽量减少空气的污染以及在移液时产生最少的气溶胶。

8)在打开试剂瓶、拿取瓶盖、镊子及玻璃移液管等时都要用火烧下：灼烧不是为了灭菌，只需在火焰上燎1~3秒即可。

灼烧一下瓶口和移液管等，使颗粒固定在表面和制造一个向上的气流，以减少掉落颗粒的数量。

培养基等试剂长时间不用时需要盖上瓶盖。

9)打开的瓶子，应放在酒精灯火焰旁，瓶盖反放朝上。

禁止在打开试剂瓶包括瓶盖的正上方进行实验操作（包括跨越敞开的开试剂瓶上方去拿取东西）。

禁止手触碰到瓶口或瓶盖。

10)将移液枪头中的液体打入培养瓶和离心管时应是悬空打入。

将培养瓶中的液体倒入废液缸以及将枪头打入废液缸时，培养瓶和枪头需要与废液缸保持一定的距离。

当枪头的尖端碰触到任何非灭菌物品包括瓶口螺纹的外缘时，必须重新换取新枪头。

当液体泼溅时应该立即用75%的乙醇擦拭该区域。

11)用PBS清洗细胞后需用移液枪吸净培养瓶中剩余的PBS，以免造成对胰酶的稀释；加入培养基终止胰酶消化后也需用移液枪吸净培养瓶中剩余的培养基以减少胰酶对细胞的损伤。

12)实验结束后，将操作台中的个人物品拿出操作台，并将公共物品摆放整齐，用酒精棉擦拭桌面，将废液缸中的废弃物倒入垃圾桶，向废液缸内喷入酒精消毒后放入操作台内。

打开安全柜的紫外灯。

3.培养箱的使用规则1)培养箱专供细胞培养用，严禁放入其他物品，以防污染。

2)从培养箱取放物品前，用75％酒精清洁双手（或手套）。

培养瓶皿放入培养箱前，用75％酒精消毒表面，尽量缩短开门时间和减少开门次数。

当培养箱的门处于打开状态时禁止说话。

3)细胞培养板或培养皿请勿堆砌过高，以防打翻。

从培养箱拿取细胞时轻拿轻放，动作迅速，随手关紧培养箱门。

未经允许，禁止翻看、移动他人细胞或样品，如有特殊需要的，请联系实验室负责人协调。

4)如不慎有培养基洒出，需及时清理消毒并更换底部托盘中的灭菌水，以防污染，同时通知仪器负责人。

5)普通培养中的细胞，若非实验特殊需要，每瓶/板细胞每天只需要观察生长状态一次，2人以上共用的细胞，可约好时间一起观察。

6)原代细胞需放置在原代培养专用培养箱培养，不得放置于其他培养箱。

7)培养箱在使用时，室内温度要保持在28℃以下，特别是夏天需要24小时开空调，否则设备会超温报警。

二氧化碳气瓶分压阀的读数应为0.04-0.06；二氧化碳气瓶总阀正常读数为5-6，低于该数值说明余量不多，需尽快更换新的气瓶；未经允许请勿调节安全阀。

8)如果报警显示Add Water，表示设备里的水套缺水，应用蒸馏水并使用附件提供的漏斗一直加到设备不报警为止，如果显示Replace HEPA，只是提醒需要更换箱内高效过滤器，不是表示设备有问题，如果不想更换可以照常使用。

9)实验人员应经常注意检查培养箱温度、CO2气体量是否相符设定值。

密切注意培养箱内的增湿盘，定期更换无菌水并进行消毒。

密切注意培养箱内情况，如出现霉变、菌斑、支原体和衣原体感染或其他明显染菌迹象，应立即通知管理员及其它使用者。

4.显微镜使用规则1)显微镜使用前应保持载物台的清洁。

2)使用显微镜观察完细胞后，应将显微镜的灯泡亮度开到最小。

离开细胞房时或较长时间不需使用时，应及时关上电源，延长灯泡寿命。

尽量避免频繁开关显微镜电源。

5.冰箱、试剂等相关操作规则1)从冰箱取放物品动作要迅速，关门时要检查门是否关好。

严禁长时间敞开冰箱门。

2)各人存放于冰箱内的培养液、生化试剂、样品要注明姓名、配制日期、样品名称，特殊试剂需获得细胞房管理人员同意后方能放置。

不得使用他人的培养液或其他生化试剂。

3)分装好的血清长时间保存于-20℃，使用前放于4℃预解冻。

原则上解冻好的血清应全部配成含血清的培养基备用，若有剩余，则暂存于4℃并尽快使用。

尽量不要使用他人开过的血清，以免交叉污染。

4)细胞室内的冰箱空间有限，尽量仅放置使用频率较高的试剂。

请勿将一些闲置试剂，污染试剂长期放置在细胞室。

5)工作人员会定期对冰箱进行清理，发现未封口、无标记、过期试剂等违规物品将全部清除出去，并且查找试剂配置人给予警告。

6.进入细胞室物品控制1)所有进入细胞室的物品需经过灭菌处理，酒精表面消毒。

2)严禁将可能含有污染物或病原菌的实验物品带入细胞室。

3)细胞室内仅放置少量实验必须耗材即可，不得整箱搬入，出现洁净室内物品堆积状况。

4)细胞室内储物柜的物品放置由相关管理人员安排，并做标记。

三、细胞培养、换液、消化传代每个人在第一次接触一种新的细胞株时，应对其细胞形态、生长速度有个明确的认识，这个过程可能需要一周左右（指熟练的人）。

细胞形态的观察可以先参考一些资料，比如ATCC网站上或一些文献中的照片。

体外培养的细胞，按其生长方式主要分为贴壁细胞与悬浮细胞两大类。

这两大类细胞在细胞换液与传代时的方式截然不同。

1.培养基颜色的观察培养基的pH直接影响到细胞的生长状况，大多数细胞的最适pH为7.4左右。

pH6.5以下为柠檬黄pH6.5为黄色pH7.0为橙色pH7.4为红色pH7.6为酚红pH7.8为紫色2.血清的使用血清可以提供细胞生长所必需的生长因子和营养元素。

我们常用的血清为小牛血清，培养基中血清的浓度为10%。

具体选择什么样的血清及血清的浓度，应根据细胞生长的特点而定，有些细胞可能需要胎牛血清，而有些细胞特别是转化后的细胞，对于血清的需要量是很低的，在0.5%左右。

A：血清一般在-20℃保存；B：体积较大的血清，融化后应分装后，-20℃保存；C：对于未灭活的血清，在常温下溶解后，56℃水浴中灭活30min，再分装于-20℃保存。

3.细胞换液细胞何时换液，依赖于细胞生长速度、细胞密度等。

一般情况下，2~3天更换一次。

同时也可以根据培养基的颜色进行判断。

培养瓶从孵箱中拿出来后，最好竖立着放，不要平放（培养基易冲出瓶盖，导致染菌），包括在超净台中的操作。

1)贴壁细胞A:倒掉旧的培养基；B:用PBS清洗：加入PBS，轻轻摇荡，倒掉（这步并非必须的，视细胞生长情况而定，一般在消化传代后第一次换液时，最好用PBS清洗）；C:加入新的培养基（一般中小号培养瓶，4~6ml左右）。

2)悬浮细胞A:培养瓶中培养基不多时：直接加入新培养基（培养瓶可以竖立着放）；B:培养瓶中培养基过多时：将细胞连同培养基一起转移到离心管中，1000rpm，5min；倒掉上清液，加入新的培养基到离心管中，吹打成细胞悬液，转移到培养瓶中继续培养。

4.细胞消化传代贴壁细胞一般采用消化传代法；部分贴壁生长细胞（半贴壁细胞）可直接吹打即可传代；悬浮细胞可采用直接吹打或离心后传代。

贴壁细胞：A：倒掉培养基；B：加入PBS清洗（必须，清洗掉含血清的培养基，一方面可以节约消化液，又能尽快的消化细胞，并且好控制消化时间）；C：加入消化液以覆盖住细胞为准，不宜过多，37℃孵箱中消化3~5min左右；D：显微镜下观察，发现细胞质回缩、细胞间隙增大后（细胞变圆），立即加入2ml含血清的培养基终止消化，弃去；E：重新加入2ml含血清的培养基，用移液管或移液枪吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，吹打时应从瓶底一边开始到另一边，以确保瓶壁上细胞均被吹打下来。

（吹打不宜过猛，避免过多的泡沫形成）F：吹打均匀，细胞计数后，吸取合适数量的细胞悬液，至新培养瓶中，再补足培养基（50ml培养瓶可加4-6ml培养基）。

悬浮细胞：操作同上述悬浮细胞换液，仅是在细胞计数后，将合适数量的细胞悬液，分配到新培养瓶中。

注意：不应待细胞长得特别满的情况下，消化细胞，因为这时细胞的活力并非最好。

应选择在对数生长期的细胞（密度大约为80%-90%）进行消化传代或冻存。

四、细胞计数1.血球计数板的使用血球计数板一般有二个小室，每个室中细刻9个1mm2大正方形（见下图），其中上下左右4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。

血球计数板上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2×0.1mm=1.0×10-4ml。

使用时，计数4大正方形内之总的细胞数目，求平均值，再乘以104，即为每ml溶液中细胞数目，再乘以稀释倍数，即可得出母液中细胞的浓度。

2.计数A：用酒精棉将计数板与盖玻片擦干净；B：盖玻片平稳地盖在计数板的中间，盖玻片与计数板的边缘相距0.5cm左右；C：用移液枪取20μl左右细胞悬液，滴加到盖玻片与计数板的边缘空隙处，让液体通过毛细管现象自然吸附进盖玻片下计数板的小室中；D：显微镜下统计4个方格中的细胞数目，求平均值，即可得到细胞悬液中细胞浓度，（比如：四个方格中的细胞数分别是15、18、17和14，平均为16，那么细胞浓度为16×104=1.6×105个/ml）。