防止血液凝固 生理盐水 蒸馏水和甲苯 去除样品中相对分子质量较小的杂质 凝胶色谱法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 洗脱液流干 均匀、一致地移动

【解析】

血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。实验步骤 ：（1）样品处理：①红细胞的洗涤，洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞，吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。②血红蛋白的释放，在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白，加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。③分离血红蛋白溶液，将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层，第一层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。④透析，取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中，透析12h，透析可以去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。（2）凝胶色谱操作，凝胶色谱法所用的凝胶是一种微小的多孔球体，在小球内部有许多贯穿的通道，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢，相对分子质量较大的蛋白质只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快，相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离，通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，实现样品的纯化。如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整的随着洗脱液缓慢流出。（3）纯度鉴定，判断纯化的蛋白质是否达到要求，可利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。

（1）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，加入柠檬酸钠的目的是防止血液凝固。洗涤红细胞时要用生理盐水反复洗涤、离心，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。为了让红细胞破裂，要加入蒸馏水和甲苯。

（2）得到的血红蛋白溶液装入透析袋中透析，透析可以去除样品中分子量较小的杂质。

（3）然后通过凝胶将色谱法对样品进一步纯化，最后进行纯度鉴定，使用最多的是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

（4）在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙：一是在装填凝胶柱时，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果；二是凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象；一旦发生上述情况，凝胶色谱柱需要重新装填。在蛋白质分离过程中，需仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况，如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。