高效液相色谱 ( HPLC)广泛应用于医药卫生、食品安全、环境化学等各个领域。在使用过程中难免会遇到各种各样的问题，从而影响正常工作，如何快速发现故障、排除故障，并做好预防维护措施及其重要，小析姐列举了常见故障的排除及解决方法，仅供大家参考。

压力波动问题

1、压力高

压力偏高或超过压力上限一般是由方法问题、误操作、系统堵塞、压力传感器故障等问题引起。

方法问题：在方法建立时柱温、流速等参数建立不当，当使用小粒径色谱柱或背压大的色谱柱时，可降低流速或升高柱温（如35～40℃），以降低系统压力，该问题多发生在建立方法时。

误操作：当压力高于平时压力时首先检查柱温是否设置错误、流动相溶剂是否使用错误（如错将甲醇用成了粘度高的乙腈）、色谱柱是否拿错等误操作。

系统堵塞：排除方法问题及误操作后，排查是否系统堵塞，进行分段排查，可依次松开管路接头，从HPLC出口端开始，向上游泵逐个检查，这是发现堵塞部位最简单的方法，确定堵塞部位后可进行直接更换（如安捷伦的过滤白头等）、或超声清洗（如waters的在线过滤器等）、或反冲（如六通阀、进样针、针座、管路等部位），如超声清洗或反冲无效则需更换，经排查是保护柱或色谱柱堵塞时按相关方法冲洗。

压力传感器故障：上述排查后未发现压力高原因，则需要更换压力传感器，联系仪器客服咨询。

2、压力低

压力偏低或无压力一般是由误操作、漏夜、泵不输液等问题引起。

误操作：泵关闭、打开了排空阀等误操作引起无压力、柱温设置错误、用错溶剂、用错色谱柱等误操作可能导致压力偏低或偏高。

漏夜：压力偏低或无压力很多时候是由漏夜引起，配有漏夜感应器先确认哪个模块漏夜报错（此时已经严重漏夜），清除错误后重新启动泵排查该模块漏夜位置（用滤纸或纸巾逐个接口试漏），未配有漏夜感应器或轻微漏夜时由泵至检测器逐个接口排查（漏夜多发生在色谱柱接口及泵各接口）。确定漏夜位置根据漏夜原因进行处理，如接口松动重新拧紧、如密封圈磨损更换密封圈等。

泵不输液：流动相走空、管路中有空气、未充分排空、溶剂入口过滤头堵塞、单向阀污染均可能引起泵不输液。首先检查溶剂瓶内是否有溶剂、管路中是否充满气体，进行排空（如排空废液口无液体流出使用注射器手动抽，至有连续液体流出）；排空后依然无压力、压力偏低或压力波动，且废液口无废液流出，超声清洗单向阀或更换单向阀，无改善将溶剂入口过滤头取下，查看压力是否正常，如滤头堵塞超声清洗或更换（注：安捷伦溶剂入口过滤头为陶瓷材质，不可以超声，使用1%～10%硝酸浸泡过夜）。

保留时间变动

如果所有峰（色谱峰）的保留时间均发生了变化，其原因很可能是流动相的组成、色谱柱的化学性质、色谱柱的温度或流速、在线混合时比例阀故障等。

1、流动相的组成

如果操作人员操作不当，则会导致流动相组成的意外变化，例如使用在线式混合系统时，流动相混合物（系统）设置不正确；或替换新批次流动相时，未妥善制备新的流动相（新流动相配制不正确）。在极少数情况下，会出现流动相组分选择性损失的情况，例如蒸发。

当流动相发生变化时，峰形（色谱峰）通常会向相同的方向移动，以缩短或延长保留时间（保留时间变长或变短）；而相对保留通常会发生变化。检查流动相组成错误的最佳方法是仔细检查（复查）系统设置；如有必要，应制备新的流动相。

2、色谱柱化学（化学性质）变化

一般会在色谱柱使用数周或数月内逐渐变化。柱老化一般伴随着柱背压的上升、保留时间的逐渐变化（漂移）（更长或更短）以及更多的峰拖尾。更换新柱以确定是否是柱老化导致的保留时间变动。

3、色谱柱温度变化

柱温变化会导致保留时间的变化，每1℃的温度变化会引起1-3％的保留时间变化。如果不使用柱温箱（即“室温”条件），实验室温度通常会变化。尤其是当供暖或空调通风口直接吹向系统时，温度变化极为明显。使用柱温箱可以避免色谱柱出现这样的温度问题，且HPLC系统应远离通风口放置。

4、流速变化

可能是因存在气泡、泄漏或泵问题（故障）导致流速与设定值发生变化，导致保留时间变化。

5、气泡问题

可能伴有柱压过低或柱压波动，且保留时间延长。对于双头泵，如果只有一个泵头存在气泡，则流量和压力可能会发生脉动。

6、泄漏也会延长保留时间

查看接头如有液滴或结晶析出，可证明有泄露。请特别注意色谱柱之前的接头。如果使用不锈钢配件，通常将接头螺母手动拧紧，再扳手拧紧1/4圈，便可以阻止泄漏。使用PEEK接头时，应停止泵，松开接头，将管路推到接口端口的底部，再拧紧接头。拧紧PEEK接头时如果存在流动的液体，会导致管道在配件中滑动，产生柱外死体积，进而影响分离效果。

7、单向阀污染或泵密圈磨损会导致流量偏低或波动，从而导致保留时间变化

单向阀污染可以进行超声清洗，随着使用时间的增加，泵密封圈会出现磨损，而且使用高浓度缓冲盐为流动相，会缩短泵密圈的使用寿命，可以根据使用情况及密封圈故障率定期更换密封圈，通常一年更换一次即可。

色谱峰问题

1、拖尾峰

（1）筛板阻塞：柱子两头的过滤筛板如果堵塞，样品就会在筛板部分受阻而形成时间延迟，使得样品在柱后流出时峰型形成拖尾。需要通过反冲色谱柱，或者更换筛板。

（2）色谱柱塌陷：是指色谱柱由于其它原因引起了柱效率丧失，不能对物质形成保留，使得物质不在固定相上保留而随流动相流出，但是又还有一点柱效，因此形成拖尾。需要重新填充色谱柱或者更换色谱柱。

（3）有污染：即样品不在同一起跑线起跑，从后面开始跑得到达终点稍晚，表现出拖尾。更换色谱柱或者采用有机溶剂梯度洗脱1h以上，以冲洗柱子。

（4）流动相PH值选择错误：如某PH下有的样品存在分子型和离子型的动态平衡，离子型的陆续向分子型转化就会表现出拖尾。调节PH值可抑制分子解离，改善拖尾，对于碱性化合物，相对较低的PH值更有利于得到对称峰。

2、前沿峰

（1）样品过载：被保留的样品在正常出峰时间前陆续出来，形成前沿峰。降低样品含量。

（2）样品溶剂选择不恰当：当样品溶剂的洗脱能力大大强于流动相时会出现前沿峰，例如，在反相色谱中用已腈做样品溶剂，而流动相的洗脱力较弱时会出现前沿峰。选择流动相或者接近流动相的比例作为样品溶剂。

（3）色谱柱损坏：色谱柱柱效损失，不能对物质形成保留。更换色谱柱。

（4）在大峰前有小峰出现，假象前沿峰，即大峰前包埋了没有分开的小峰。调整流动相洗脱梯度。

3、倒峰

（1）样品折射率小：示差折光检测器测的信号是折射率，出现倒峰的原因是组分的折射率小于流动相。

（2）密度的原因：密度不一样，出来的峰正倒不一样。

（3）进样所致：进样时，样品对原有流动相产生瞬间阻断，然后瞬间涌流，所以产生先倒后高的“溶剂峰”。

（4）基本不可避免：试着使用与流动相相同的溶剂作为溶样溶剂，另外进样之前注意平衡跟冲洗参比池。倒峰基本上不能避免，但是这样操作会小些。

4、包裹

（1）色谱柱问题：色谱柱流失，柱子被污染。

（2）样品溶解度差：温度可能会影响到溶解度。

（3）流动相不均匀：一般是流动相没配好，管路流动相不均匀，也会导致上述现象。

5、基线漂移

（1）柱温波动：即使是很小的温度变化都会引起基线的波动，通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。使用柱温箱，控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器。

（2）流动相不均匀：流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。使用HPLC级的溶剂，流动相在使用前进行脱气处理。

（3）流通池被污染或有气体：用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸(不要用盐酸)。

（4）流动相配比不当或流速变化：更改配比或流速，为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。

（5）样品中有强保留的物质：以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。

6、出现宽峰

（1）色谱柱污染或失效，造成塔板数降低：更换同样类型的色谱柱，如果新柱子可以提供对称的色谱峰，则用强溶剂冲洗旧柱子。

（2）柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大：更换内径较小的短管路。

（3）检测器对反应时间或池体积响应过大：减少响应时间或使用更小的流通池。

7、基线噪音

（1）在流动相、检测器或泵中有空气(尖锐峰)：流动相脱气，冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。

（2）漏液：检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换泵密封。

（3）流动相混合不完全：用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂。

（4）温度影响(柱温过高，检测器未加热)：使用柱温箱，减少温度差异或加上热交换器。

（5）在同一条线上有其他电子设备(偶然噪声)：断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部，加以更正。采用精密级稳压电源。

8、分离度不够

（1）流动相梯度洗脱设置不合理：优化梯度洗脱程序。

（2）流动相污染或变质(引起保留时间变化)：重新配置流动相。

（3）保护柱或分析柱阻塞：去掉保护柱进行分析，如果必要则更换保护柱；如果分析柱阻塞，可进行反冲；如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏，建议使用恰当的再生程序；如果问题仍然存在，进口可能阻塞了，更换入口处的筛板或更换色谱柱。

漏液问题

1、接头处漏液

接头处漏液一般发生在色谱柱接头处，此处的漏液现象比较直观，一般是液体积流在色谱柱头，造成压力波动。通常可以通过拧紧或更换管路接头来解决漏液的问题。但值得注意的是过份拧紧会导致金属接头的漏液和塑料接头的磨损。

如果通过稍微拧紧接头不能解决漏液的问题，就必须将接头取下，检查是否损坏(例如，卡套损坏、密封表面有杂质)；损坏的接头应该更换掉。

参考下表：

 

2、进样阀漏液

（1）转子密封圈磨损太厉害或者损坏，造成密封不严。拆下六通阀，检查转子密封圈，可单独购买，根据说明书自行安装更换。如果定子磨损比较严重的话，有必要也需更换。 

（2）废液管产生虹吸或者堵塞，造成废液逆流。此时需要保持废液管高于废液液面，或者更换、疏通废液管，保证废液排放正常。

（3）进样口密封松动或者进样针头尺寸不合适。需要调整进样口的密封圈或者更换合适的进样针头。

 

具体方法：

 

3、泵漏液

泵头漏液一般都是由于密封不好引起的，需要检查相关接口处的密封状况。

（1）单向阀、接头松动。这是首先要排查的项目，但单向阀和接头也不能拧得过紧，避免磨损。

（2）柱塞杆磨损刮伤或者柱塞密封垫损坏导致的柱后漏液，这是最常见的问题，此情况一般会出现以下三种现象，一是柱塞杆磨损导致与密封圈之间有微小缝隙;二是柱塞杆与密封圈不匹配;三是泵头紧固螺钉没有拧紧。在确定拧紧的情况下，需要更换柱塞杆或柱塞密封垫。

（3）比例阀损坏。首先检查手紧接头，如有损坏，则立即更换;再检查隔膜，如果发现漏液则立即更换。

 

具体方法：

 

4、检测器漏液

（1）流通池垫片损坏，造成漏液。在使用过程中避免过大的压力，拆开流通池，检查垫片，损坏严重时需要更换垫片。 

（2）废液管破裂。在人为外力的作用下，废液管受到挤压造成破裂，打开检测池，检查管路，如果破裂，需更换。

（3）流通池阻塞。当流通池阻塞时，其内部压力升高，可能会造成池子窗口破裂，此时需要清洗流通池，有必要时需要更换流通池或者池子窗口。

 

具体方法： 

 

5、色谱柱漏液

流动相常见问题

1、流动相脱气不充分

流动相受热，或者流动相不同组分混合时会有气体产生，气泡进入泵内引起压力波动，增加噪音，色谱图上出现毛刺。可试用下列方法解决问题：流动相再脱气；采用更有效的脱气方法或两种方法配合使用；改系统内混合为系统外预混合。

 

2、流动相供给不畅

流动相用完，管道中吸入气体引起泵压力不稳。应经常观察储液器中流动相的量，加足流动相保证所有的样品分析完毕。输液管道上装沉子沉至瓶底，储液器盖上留一小孔正好夹住进液管，使其不能上下移动。

过滤器阻塞引起管道和泵腔空化，压力不稳。过滤器被微粒所阻塞或长霉，去掉过滤器后如果系统运转正常，说明已找出问题，换上新的过滤器则可。有时候换上新的过滤器仍然不畅，那就需要查查流动相的制备过程，或者换大孔径的过滤器。不管如何，流动相都需要重新过滤。

流速过高、阻力大，造成空化现象，这是由于过滤器孔径、管道内径、流速和溶剂黏度等引起的。如果流速大于10mL/min，常会出现这种现象。

使用下列方法解决：

（1）使用低流速；

（2）换大孔径的过滤器；

（3）增加进液管道内径；

（4）抬高或加压储液器；

（5）不用过滤器，但流动相一定要先过滤；

（6）储液器盖子太紧，在储液器内形成真空，打出的流动相不连续。应松开盖子或留有1mm的缝隙；

（7）进液管道阻塞或弯曲使泵抽不到液，注意调整进液管道或更换新的。其它问题包括渗漏或接头松动、泵部件损坏等，都能引起供液不正常。

 

3、流动相和储液器被污染

由于污染，噪音越来越大，检测器基线上升。污染物可能被泵以稳定的浓度打入系统，而再以稳定的浓度流出来，所以在色谱图中不出多余的峰。用梯度洗脱时弱流动相可以使污染物聚在柱顶，流动相强度增加后污染物可能被洗脱出来一个大的伪峰。有时基线噪音突然增大或突然提高，都是因为反复加进新的流动相或系统用得太久（通宵）所造成的。新加进的流动相有污染物或者流动相长霉，繁殖了细菌。

 

脏的储液器会污染清洁的流动相。每种流动相备有专用的储液器，或者定期报废储液器。

 

4、流动相污染来自这几个方面：

试剂质量不高，玻璃器皿不合格；

微生物的影响；

配制流动相时操作不当等；

因此要求高纯度化学试剂和HPLC级溶剂；

玻璃器皿按规定清洗干净；

为防止微生物生长，每天要用甲醇清洗系统；

怀疑系统内生长了微生物，可用稀硝酸冲洗即可（注意不要损坏柱和管道系统）；

真空脱气时防止泵油带入流动相；

用清洁的惰性塞子、搅棒、过滤器和玻璃器皿配制流动相；

已经污染的流动相一定要废弃掉。

许多液相色谱的故障是可以通过日常维护避免的， 所以，做好液相色谱的日常维护，才是解决液相色谱常见故障的法宝。

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