Exosomes Derived From Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells Treat Cutaneous Nerve Damage and Promote Wound Healing

脐带间充质干细胞来源的外泌体治疗皮肤神经损伤并促进伤口愈合

摘要

伤口修复是治疗烧伤、手术和外伤引起的皮肤损伤的关键步骤。各种干细胞已被证明可以作为候选种子细胞促进伤口愈合和皮肤再生。因此，源自干细胞的外泌体正在成为一种有前途的伤口修复方法。然而，外泌体促进伤口修复的机制仍不清楚。在这项研究中，作者报道了源自脐带间充质干细胞 (UC-MSCs) 的外泌体通过治疗皮肤神经损伤促进伤口愈合和皮肤再生。结果表明，UC-MSCs外泌体（UC-MSC-Exo）促进真皮成纤维细胞的生长和迁移。在体外培养中，真皮成纤维细胞在外泌体刺激下可促进神经细胞生长并分泌神经生长因子。在修复过程中，UC-MSC-Exo 加速了创伤部位成纤维细胞的募集，并显着增强了体内皮肤神经再生。有趣的是，发现 UC-MSC-Exo 可以通过招募成纤维细胞、刺激它们分泌神经生长因子 (NGF) 和促进皮肤神经再生来促进伤口愈合和皮肤再生。因此，作者得出结论，UC-MSC-Exo促进皮肤神经修复，可能在伤口修复和皮肤再生中起重要作用。

 

研究思路

1. UC-MSC细胞的培养和鉴定

 

 

                          图1

干细胞已被用于治疗皮肤损伤，干细胞衍生的外泌体也具有皮肤修复作用。细胞形态可以直接反映细胞的生理状态。接种后，在无血清培养基中孵育的UC-MSC的形态显示出典型的纺锤体形状（图 1A），具有均匀的形状，清晰的轮廓和理想的细胞粘附效果。然后，分析UC-MSCs表面标志物，采用流式细胞术测定UC-MSCs上细胞表面抗原CD79a、CD45、CD14、CD105、Thy1和CD73的表达情况。结果显示，CD105、Thy1 和 CD73 表达为阳性，CD79a、CD45 和 CD14 表达为阴性（图 1B)。通过初步实验，获得了稳定的间充质干细胞。

 

2. UC-MSC-Exo的提取和表征鉴定

 

图2

从UC-MSCs的上清液中分离出 MSC-Exo，并通过TEM、粒度测量和蛋白质印迹分析对其进行分析。 通过蛋白质印迹分析在外泌体样品中检测到外泌体标记CD9和TSG101（图 2A）。 TEM 显示UC-MSC-Exo具有典型的MSC-Exo杯形形态（图 2B）。 使用NanoSight LM 10 系统分析UC-MSC-Exo的样品，图片显示粒子呈布朗运动（图 2C），95.94% 的粒子在56.07–115.71nm的尺寸范围内（图 2D）。

3. 脐带间充质干细胞外泌体促进皮肤成纤维细胞增殖

 

图 3

为了探索这些外泌体调节成纤维细胞迁移的能力，进一步使用HDF进行了划痕试验，以评估MSC-Exo的伤口愈合能力。如图 3A、B 所示，MSC-Exo组显示出比对照组更强的细胞迁移能力。成纤维细胞呈梭形或扁平星形（图3C），功能旺盛，蛋白质合成和分泌活动明显。波形蛋白是皮肤成纤维细胞的标记蛋白，β-微管蛋白是细胞内微管的基本结构单元，在维持细胞形态、运动和细胞内物质转运等方面发挥着不可或缺的作用。在成纤维细胞中，波形蛋白（绿色）和β-微管蛋白（红色）均表达良好（图 3D）。外泌体促进成纤维细胞增殖，可能对皮肤伤口修复有积极作用。

 

 

4. 脐带间充质干细胞外泌体促进愈合过程中皮肤成纤维细胞分泌神经生长因子

 

图 4

为了进一步确定外泌体和神经之间的关系，作者研究了MSC-Exo对参与伤口愈合过程中神经生长因子（NGF）分泌的影响。神经因子的水平由相关mRNAs的表达决定。对照组神经生长因子的表达较低，在MSC-Exo处理下，神经生长因子含量发生显着变化，TAC4 mRNA表达在48 h时达到最高水平（图4A）。TAC2的表达随时间逐渐增加，与对照组相比，TAC2的 mRNA 表达在24和48 h时显着增加（图 4B）。CALCB和VIPR1的表达在治疗后24小时达到最高水平（图 4C，D）。TACR1的最高表达水平出现在24小时（图 4E）。结果表明，与对照相比，MSC-Exo显着促进NGF的分泌，差异有统计学意义（P < 0.05）。这一发现进一步验证了外泌体可能通过促进神经修复在促进伤口愈合中发挥作用。

 

 

5. 脐带间充质干细胞外泌体在体内伤口愈合过程中加速皮肤伤口修复和皮肤再生

 

 

图 5

为了验证体外实验结果，作者进行了体内实验。为了确定UC-MSC-Exo对伤口愈合的影响及其在此过程中的作用，作者在每只小鼠的背部进行全层皮肤伤口。用UC-MSC-Exo或PBS 治疗小鼠背部的全层皮肤伤口。在第14天分析再生真皮的组织学结构，包括5 mm的完整皮肤边缘，将其包埋在石蜡中并从边缘到中心点连续切片。伤口治疗后第0、3、7 和14天各组伤口区域的代表性图像如图 5A、B 所示。体内实验结果显示，对照组第3天创面明显红肿，炎症症状强于治疗组。伤口愈合过程分为止血期、炎症反应期、增殖期和重塑期4个阶段。如图所示，由于外泌体的作用，皮肤已经过了炎症期，创面开始收缩。第7天，对照组的伤口出现了一些炎症反应，而实验组出现了结痂。与对照组相比，UC-MSC-Exo治疗组伤口恢复得更快（图 5C、D）。HE染色显示，与对照组相比，治疗组表皮舌生长增强，创面修复时间缩短（图5E-H），与体外实验结果一致。这些结果表明，MSC-Exo治疗加速了伤口愈合。

 

 

6. 脐带间充质干细胞外泌体促进皮肤神经纤维再生

图 6

 

图 7

作者通过使用免疫荧光对神经再生进行了系统评估。通过PGP9.5和GAP43的免疫染色分析皮肤神经纤维再生。如免疫荧光分析所示（图 6），用针对PGP9.5的抗体特异性染色的皮肤神经组织沿神经纤维表现出强烈的染色，PGP9.5在皮肤纤维中被发现。相比之下，在对照组中没有观察到这样的结果，没有抗体的对照染色仅显示背景 (图 6A, B)。在体外UC-MSC-Exo通过细胞增殖和神经损伤修复促进伤口愈合。皮肤细胞也参与伤口修复过程，通过表达神经相关标志物和调节神经因子来促进神经再生（图7）。这一发现表明，在皮肤神经损伤过程中，通过改善皮肤神经周围环境来修复神经是一种很好的策略。

 

 

结论

在本研究中，作者使用UC-MSC-Exo研究了干细胞外泌体在皮肤伤口愈合过程中对皮肤神经的影响，并将其应用于小鼠皮肤损伤模型，以验证其促进皮肤神经修复和再生的能力。这种治疗对损伤修复有积极作用。研究的主要结果可归纳如下：（1）在体外，UC-MSC-Exo刺激成纤维细胞增殖； (2) UC-MSC-Exo促进神经生长因子的分泌； (3) UC-MSC-Exo 在全层皮肤切除模型中加速伤口愈合。在本文中，作者展示了UC-MSC-Exo有望用于治疗皮肤和神经再生的证据。