1、所有试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品，建议做复孔。
2、按前面试剂准备中描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。
3、从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。
4、设置标准品孔、样本孔和空白孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL，样本孔加待测样本50μL，空白孔不加，用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱温育30min。
5、揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置20s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干。如此重复4次（共洗板5次）。若使用自动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，添加浸泡20s的程序，可以提高检测的精度。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。
6、除空白孔外，标准品孔和样本孔，加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL。
7、用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱温育30min。
8、揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置20s，甩去洗涤液，吸水纸上拍干。如此重复4次（共洗板5次）。若使用自动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，添加浸泡20s的程序，可以提高检测的精度。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。
9、将底物A和B按1:1体积充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜盖住反应板，37℃水浴锅或恒温箱温育15min。
10、所有孔加入终止液50μL，在酶标仪450nm波长下读取各孔吸光度（OD值）。
结果计算
11、以标准品浓度做为横坐标，对应的吸光度（OD值）作为纵坐标，利用计算机软件，采用四参数Logistic曲线拟合（4-pl），创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（OD值），利用方程计算样品的浓度值。【用ELISA Calc软件计算】
12、如果样品被稀释，通过上述方法测的的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品的最终浓度。