半自动生化仪怎么用《临床生物化学》·第十九～二十章·临床生物化学分析仪的性能与应用·临床生物化学方法的选择、建立和评价
临床生化自动分析仪，就是把生化分析中的取样、加试剂、去干扰、混合、保温反应、检测、结果计算、显示和打印，以及清洗等步骤自动化的仪器。它完全模仿并代替了手工操作。不仅提高了工作效率，而且减少了主观误差，稳定了检验质量。由于这类仪器一般都具有灵敏、准确、快速、节省和标准化等优点，使得生化自动分析仪在临床生化分析中得到了广泛应用。
一、概述
自50年代Skeggs首次介绍一种临床生化分析仪的原理以来，随着科学技术尤其是医学科学的发展，各种生化自动分析仪和诊断试剂均有了很大发展，根据仪器的结构原理不同，可分为连续流动式（管道式）、分立式、离心式和干片式四类。新型的自动分析仪常装有：样品识别、自动加样、自动检测、数据处理、打印报告和自动报警等装置。
（一）管道式分析仪
管道式分析仪的特点是测定项目相同的各待测样品与试剂混合后的化学反应，是在同一管道中经流动过程完成的。这类仪器一般可分为空气分段系统式和非分段系统式。所谓空气分段系统是指在吸入管道的每一个样品、试剂以及混合后的反应液之间，均由一小段空气间隔开；而非分段系统是靠试剂空白或缓冲液来间隔每个样品的反应液。在管道式分析仪中，以空气分段系统式最多，且较典型，整套仪器是由样品盘、比例泵、混合管、透析器、恒温器、比色计和记录器几个部件所组成（图19-1）。管道内的圆圈表示气泡，气泡可将样品及试剂分隔为许多液柱，并起一定的搅拌作用，但气泡影响比色，必须在比色前除去。
图19-1 单通道管道式自动分析仪结构示意图
将几个单通道管道式分析仪结合起来，对一个样品同时测定几个项目。著名的有12通道分析仪，命名为顺序多项自动分析仪（sequential multiple autoanalyzer），简称SMA12/60。同时发展为SMAC，C为计算机（computer）的缩写。这类大型分析仪至今仍有使用者。它对每个样品可同时分析12个项目，每小时可分析60个样品。后来发现不加入空气泡，更有利于结果的检测，发展为流动注射分析法（flowinjection analysis）。试剂的流动仍用比例泵驱动，样品用转动阀加入液流，反应后比色检测。
（二）分立式分析仪
所谓分立式，是指按手工操作的方式编排程序，并以有节奏的机械操作代替手工，各环节用转送带连接起来，按顺序依次操作。分立式分析仪与管道式分析仪在结构上的主要区别为：前者各个样品和试剂在各自的试管中起反应，而后者是在同一管道中起反应；前者采用由采样器和加液器组成的稀释器来取样和加试剂，而不用比例泵；前者一般没有透析器，如要除蛋白质等干扰，需另行处理。恒温器必须能容纳需保温的试管和试管架，所以比管道式分析仪的体积要大。除此以外，其它部件与管道式的基本相似。分立式分析仪的基本结构如图19-2。Dupout公司还推出一种袋式分析仪，即试管变为塑料袋，反应在袋内进行，也以袋作比色杯。这种袋只能一次性使用。
图19-2 分立式自动分析仪结构示意图
（三）离心式分析仪
离心式分析仪是1969年以后发展起来的一种分析仪，由Anderson设计，其特点是化学反应器装在离心机的转子位置，该圆形反应器称为转头，先将样品和试剂分别置于转头内，当离心机开动后，圆盘内的样品和试剂受离心力的作用而相互混合发生反应，最后流入圆盘外圈的比色槽内，通过比色计进行检测（图19-3）。这类分析仪特点是①在整个分析过程中，各样品与试剂的混合、反应和检测等每一步骤，几乎都是同时完成的，不同于管道式和分立式分析仪的“顺序分析”，而是基于“同步分析”的原理而设计。②样品量和试剂量均为微量级（样品用1-50μl，试剂120-300μl），快速分析（每小时可分析600个样品以上）。③转头是这类分析仪的特殊结构。早期的转头由转移盘、比色槽、上下玻璃卷和上下套壳六个部件组成，现已被一次成型的塑料制品代替。转头转动时，各比色槽被轮流连续监测，如转速为960r/min，转头上有20个比色槽，则每分钟可接受19200个电信号，配有微机进行控制和数据处理。
图19-3 离心式自动分析仪工作原理示意图
离心式分析仪主要由两部分组成，一为加样部分，二为分析部分。加样部分包括样品盘、试剂盘、吸样臂（或管）、试剂臂（加液器）和电子控制部分（键盘和显示器等）。加样时转头置于加样部分。加样完毕后将转头移至离心机上。分析部分，除安装转头的离心机外，还有温控和光学检测系统，并有微机信息处理和显示系统。
（四）干片式分析仪
干片式分析仪是80年代问世的。首先Eastman Kodak公司以其精湛的化学工艺造出了测定血清中血糖、尿素、蛋白质、胆固醇等的干式试剂片。当加上定量的血清后，在干片的前面产生颜色反应，用反射光度计检测即可进行定量。这类方法完全革除了液体试剂，故称干化学法。Boehringer Mannheim公司推出了用全血的干征试剂。即将血细胞排除于滤膜之外，而血浆与试剂发生反应后显色检测。干片试剂结构示意图见图19-4。
图19-4 平片试剂结构示意图
干片不仅包括试剂，也可由电极构成，所以这类分析仪也可进行电解质的测定。这类干片均为一次性使用，故成本较贵。
二、半自动生化分析仪
半自动生化分析仪指在分析过程中的部分操作（如加样、保温、吸入比色、结果记录等某一步骤）需手工完成，而另一部分操作则可由仪器自动完成。这类仪器的特点是体积小，结构简单，灵活性大，既可分开单独使用，又可与其他仪器配套使用，价格便宜，一般在分立式分析仪中多常见。
荷兰VitalScientific生产的ISP-M半自动生化分析仪，是一种典型且性能比较好的半自动生化分析仪，能应用于动力学法、两点法及终点法的检测，可以采用人机对话的方式把要检测的30个项目的各参数输入仪器进行贮存，也可以随试验项目、方法、试剂等条件的改变而随时进行修改。它有一个微量流动比色杯，因此每次检测所需反应液很少，一般用400μl左右即可。还有一个非常敏感的能控制三种温度（25℃、30℃、37℃）的恒温器，能在数秒钟内迅速达到要求的温度。所有的检测步骤及试剂结果，可由显示窗显示及由打印机自动打印出来。
这类仪器一般不受试剂、方法的限制，国产试剂、自己配制的试剂及自行设计的方法均可在仪器上进行检测，而且由于仪器的体积小、重量轻、操作方便、反应迅速，尤其适合中、小型检验单位作为日常生化检测的主要仪器，也适用于作急诊生化检测及外出执行任务时使用。
这类仪器使用时应注意：①大多使用固定的比色池，结果的重复性比较好，但由于检测方法、所加试剂及样品量都很少，因此要特别注意取样和加试剂的准确性。②如反复出现非线性（NL）大于10％，应考虑试剂是否变质及所编程序是否合适。③在作动力学方法检测时，要注意试验的反应原理，如果是吸光度下降的应在浓度因数（F）值前面加负号，否则结果不准。做酶动力学方法检测时，还要注意开始的吸光度（Ai），如果特别低，可能由于样品中酶活力较高，在延迟时间内基质已被消耗完。此时，必须把样品进行稀释后再进行检测。④出现仪器不吸液体，常常由于仪器长时间不用，吸液管被压扁而堵塞，只要稍加揉擦即可畅通，如管道由于不及时清洗而造成的堵塞，这就要进行清洗或更换。⑤在使用过程中，严格吸入强酸试剂，否则将会损坏吸管的金属头，每次使用完毕，都必须用蒸馏水冲洗比色池和管道，如果在反复多次吸入蒸馏水后，不能调整零点，应用清洁液浸泡比色池。具体操作是将温度放在37℃，用10％清洁液（dete-rgent）充满比色池，浸泡15分钟，再用水冲洗。仪器长时间不用，应在一个月内通电一次，否则仪器内程序的记忆即消失。
三、全自动生化分析仪
全自动生化分析仪，从加样至出结果的全过程完全由仪器自动完成。操作者只需把样品放在分析仪的特定位置上，选用程序开动仪器即可等取检验报告。由于分析中没有手工操作步骤，故主观误差很少，且由于该类仪器一般都具有自动报告异常情况，自动校正自身工作状态的功能，因此系统误差也较小，给使用者带来很大的便利。
自美国Technicon公司于1957年成功地生产了世界上第一台全自动生化分析仪后，各种型号和功能不同的全自动生化分析仪不断涌现，为医院临床生化检验的自动化迈出了十分重要的一步。这类仪器的功能全，灵活性大，易于操作，大多采用吸光度、荧光、光散、浊度测定技术和离子选择电极系统，用于常规生化、特殊蛋白和药物监测等检测，可随机安排程序，既可根据需要输入单一项目成批分析，又可按临床医生根据患者病情不同要求，选择性的多项组合分析；结果报告既能打印出每个项目的报告，也能按人打印出所做全部项目的累积报告。在测试过程中可随时加入急诊项目，优先分析，打印出报告后，仪器仍按原输入程序继续进行检测。仪器以微机控制，采用人机对话方式来安排程序操作，可自由编排和清除程序，可贮存100个以上分析方法，可进行统计学处理，求均值、标准差、变异系数、相关系数等。有的分析仪采用了化学惰性“液囊式技术”（capsulechemistry technology），可将不同的分析标本或各种试验项目严格地分立开，互不掺杂，无需用水作为冲洗系统去防止交叉污染，更有利于随时任选项目检测。
这类仪器适应在大、中型检测单位用于临床生化项目的检测。
纵观临床生化自动分析仪的发展史，也是临床生化检测方法学的发展史，最初出现的管道式分析仪适应了化学分析的需要，设计了透析器等排除蛋白质干扰的装置，但是随着表面活性剂的应用，消除了蛋白质的沉淀干扰，已无必要进行透析分离。随着酶试剂的生产，许多以特异性酶促反应的测定方法，消除了干扰物的影响。这是分立式和离心式分析仪发展的原因之一。干片式分析仪更是试剂生产工艺革新的产物。随着方法学的改进，分析的反应部分的体积逐渐缩小，而检测、监控和信息处理部分，多数由微机担任，体积则逐渐扩展，直至可将测定结果通过网络系统，输送至病房。有人预言，随着电化学分析法的进展，各种特异性电极的研制成功，将来的自动分析仪有可能由许多精细的电极组成，则其结构将比现有的分析仪更简单化。
目前，临床生化自动分析仪的规格型号很多，生产厂也很多，随着技术的革新和应用的要求，在性能和结构上都有了很大改进和发展。正确评价与合理选用这些仪器十分重要。
一、自动化程度
对一台生化分析仪来说，自动化程度越高，说明仪器功能越强。仪器的自动化程度高低取决于仪器所使用微处理机的功能大小，根据仪器计算机功能的不同，自动化分析仪一般可分为全自动和半自动两种。
全自动分析仪比较适合于样品量多，化验项目多，人力相对不足的综合性大医院的临床化验室应用。而对于样品数量、化验项目少的小医院或专科医院使用半自动分析仪则更为合适。
二、分析效率
这里的分析效率，系指在测定方法相同的情况下不同分析仪的分析速度。显然，分析速度决定于一次测定中可测样品多少和可测项目的多少。对不同类型的分析仪，由于其结构和设计原理的不同，微机应用程序不同造成自动化程度的差异，也直接影响到分析仪的分析效率。
离心式分析仪采用同步分析原理设计，测定中所有样品的混合、反应及比色几乎同时进行。另外，其加样部分与分析部分又可各自独立工作，在一批样品分析的同时，可进行另一批样品的加样，节约了时间。因此，这类分析仪的分析速度快于其它类型。当然这也不是绝对的，当样品很少时，甚至只有一个样品，但为了保持离心机的平衡，也必须在转头的空槽中用蒸馏水一一加入方可。这样分析显然还不如用半自动的分析仪更为快一些。
三、应用范围
自动生化分析仪的应用范围包括可测试的生化项目、其它项目、反应的类型及分析方法的种类等。应用范围广的分析仪不仅能测多种临床生化检验指标，而且还可进行药物监测和各种特异蛋白的分析、微量元素测定等。分析方法除了分光光度法外，还能进行浊度比色法、离子选择性电极法、荧光法等测定。既能用终点法，又可用动态法测定。它可使酶免疫技术、固相酶技术得以应用，从而在科研和技术生产开发工作中，发挥更大的效益。有些分析仪采用了独特的双波长光路设计，可消除“背景噪声”，排除样品中溶血、脂血及胆红素等成分的干扰，精确灵敏，在一些特殊的测量分析中很有用。通常小型的、程序固定式的半自动化的分析仪，其工作应用范围相对较窄，选择时应予注意。
四、分析准确度
生化分析仪测量的准确度愈高愈好。准确度取决于各部件（加液、温控、波长、记时等）的加工精确度及其精确的工作状态。如有的分析仪采用样品液体感应探针，准确吸样，使样品携带率低于0.5％，不仅能准确地吸取微量样品，而且还能充分混合样品及试剂，使测量结果精确度提高。另外，克服分析仪中交叉污染，也是保证测定结果准确的重要环节。生化分析仪一般对取样探针有自动清洗装置，从而保证测试结果的准确率。
除此之外，仪器的寿命、仪器的维修保养方式和途径、测定所需样品和试剂的数量，以及配套试剂盒的供应等，特别是仪器的性能价格比，在选用时都应一并考虑，使选用的分析仪能够物尽其用，且又经济实惠，能够取得最大的效益。
自动分析仪的应用决不仅仅是操作方法的变化，由于引进了一系列高精技术，所用的方法测定原理都有了迅速的发展。因此，用好自动分析仪的一个重要前提，必须对自动分析仪可以提供的测试方法类型、主要实验室参数和仪器室条件及仪器操作有所了解。
一、分析方法的分类
临床生化常用方法根据其测定的原理可作如图19-5法分类。一类方法是物理方法，测定是物质固有的物理特性。另一类是物理化学方法，也就是将所测定物质进行一些化学转化后再进行测定。动态法是在所测定的物质浓度在不断变化中，由传感器获得相应的改变的信号进行计算的方法。平衡法是由传感器得到相对不变的信号进行计算的方法。现在越来越多被临床生化应用的酶试剂方法，无论是用自动分析仪记录或分光亮度计或普通比色计都包括在动态法的范围内。
（一）平衡法（终点法）
这类方法的特点是被测物质（酶反应的底物）在酶反应过程中应完全被转化或消耗掉，即达到反应的终点。通常这类方法操作简单，一般不需要作标准管，通过一些已知的理化常数，例如克分子吸光系数等不难将结果计算出来。其缺点是反应时间较长，特别不适合于离心式自动分析仪。还有少数酶反应，底物并未完全消耗掉，只是达到一个动态平衡，此时，往往需要同时作标准管。
图19-5 临床生化方法的分类
⒈一步法 试剂酶的底物（S）就是所测的物质，在试剂酶作用于S后完全转化为产物（P），由于S和P具有完全不同的理化性质，从而可根据对S或P的浓度变化进行连续监测。使用最多的还是光度法，尤其是在340nm处测定NAD(P)H的生成或消耗量。在实际应用上最多的仍是和NAD(P)H有关的脱氢反应。如用乙醇脱氢酶测乙醇的含量或用乳酸脱氢酶测丙酮酸等。
⒉酶偶联反应和测定酶活性方法一样，有时单用一个酶（辅助酶，Ea）不行，因为S和P之间往往无明显差异，不能直接测定，此时可以加入另外的酶（指示酶，Ei），将反应偶联起来，通过测定指示酶反应间接推算出所测物质，即第一个酶作用底物的浓度。
反应通式如下：
若Ei是一个脱氢酶，在反应过程中同时伴有NAD(P)H和NAD(P)间的转化，故不难在340nm处进行连续监测。另一常用的酶是过氧化物酶，可以通过新生态氧和一些色素原作用显色而进行测定。例如用已糖激酶（HK）法和葡萄糖氧化酶（GOD）法来测定葡萄糖等。
另外，还有一类少用的偶联酶反应，指示酶反应在辅助酶反应之前，而不是在后。
式中S1是欲测物质，往往另一底物S2不稳定，通过先行的指示酶产生S2，如乙酰CoA的测定。
其中草酰乙酸很不稳定，可通过苹果酸脱氢酶作用生成。
从理论上说酶催化反应都是可逆的反应，除水解酶外，大多数酶往往都不易将底物完全转换或消耗掉。常可通过增加不需测定的另一底物浓度，改变pH，使用捕获剂（trap-ping agent）等改变平衡点，使反应偏向一侧，达到或接近反应完全。
（二）动态法
动态法在自动分析仪中的应用十分广泛，但是动态法的分类一直比较混乱。一般可分为可变信号法和固定信号法两类。
⒈可变信号法
⑴直接法即根据所得到的吸光度变化直接计算结果：由于对所收集数据多少有很大意义，所以又区分为一点法、二点法、多点法。一点法是在一个预先设置时间测定各个标本吸光度。二点法则是在一点法基础上多测一点，即在酶反应仍未进行时的吸光度，和一点法相比可以通过空白测定扣除这部分误差，但是仍无法了解反应过程，避免不了延缓期或非线性反应所引起的误差。多点法如使用确当，对标本空白和反应过程都有详细了解，可用以下两法：
一法是求出不同测定点间吸光度的差异即所谓delta法。各点吸光度差异可用б＝△A＝An－An－1计算出。根据这些数据可以观察反应是否符合线性，并计算出被测物质浓度。偏离线性的数据在计算结果时应摒弃。很多早期自动生化仪都使用此法。另一法则是使用回归法，根据一定公式如线性公式y＝a＋bx对获得的多个数据进行计算，求出斜率b和截距a。这类方法也可用于浓度计算。和delta方法相比，不仅可适用于线性反应，也可适用于其它非线性反应。
⑵导数法在此法中使用电子线路计算出反应瞬间的一阶和二阶导数：bekman system TR就使用了这样方法，它可以同时计算出一阶和二阶导数，用二阶导数来观察哪一段反应为线性反应，并用线性反应段上的一阶导数计算出物质浓度。此法单用导数方法并不记录吸光度变化（△A），所以此法所提供的信息往往少于回归法，例如无法观察到反应中底物的消耗情况。
⑶积分法此法原理是运算放大器对反应曲线二个节段的吸光度进行积分。并计算出部分面积之差。Vitatron分析仪用此差值来考虑线性段，但仍用△A法计算结果。
⒉固定信号法测定原理是随着反应进行，通过不断添加试剂使吸光度变化在很窄范围内，此时所测的是加试剂的量，并依此来计算物质浓度。最典型例子是以对硝基酚作为指示剂的乙酰胆碱酯酶方法，在反应过程中不断加入碱以中和酶水解产物乙酸以维持pH不变，然后根据所加碱量计算酶含量。这一类方法由于操作费时麻烦，目前应用很少，但不应忘记这类方法能维持反应条件如pH的恒定性，其它如在NADH参与的反应中不断加入NADH有助于避免底物的消耗，在一些特殊情况下可能还是有用的。
由此可见，假如从方便简单不需复杂仪器而言，则一点和二点法应为首选。而回归法、积分和导数法不易进行。如从可靠性来进行比较，则多点回归法应居榜首，一点和二点法最不准确。
回归法的缺点是此法可以不考虑收集的数据是否可靠，不管各数据是否偏离曲线或明显不呈线性，也可求得一个线性方程式。所以，一个好的回归方程式还应给出标准差和有关参数，这样即可用来评价用回归法所得结果的可靠性。根据Pardue意见，使用较多数据且设计良好的回归方法是首选的。
（三）固定时间法（二点法）
固定时间法在自动分析仪中的应用，有助于我们解决反应的特异性问题，最明显的例子就是苦味酸法测肌酐和溴甲酚绿法测白蛋白。人们早就知道很多物质如维生素C、乙酰醋酸、葡萄糖、果糖以及某些药物也能和苦味酸呈色。近年来发现这些干扰物质呈色较慢，提出用自动生化仪只测定开始一分钟的反应，明显提高了苦味酸法测肌酐的特异性。用溴甲酚绿测白蛋白法，此法由于简单易行，在70年代取代了经典的盐析法，但随即发现一部分球蛋白如α球蛋白也能和溴甲酚绿结合，但这类反应比较迟，所以目前更多地使用自动分析仪测定开始一分钟的反应来计算白蛋白量。
固定时间法之所以受到愈来愈多注意，更重要因素是酶试剂的应用（详见有关章节）。
（四）空白对照方法
由于使用了各种高新技术，在自动生化分析仪中人们可以根据实际情况，使用各种空白和对照方法。
⒈固定法空白①试剂；②标本＋盐水；③标本＋空白试剂；④标本＋灭能试剂；⑤标本＋完全试剂（时间不同）；
⒉动态法空白①试剂空白；②标本＋空白试剂。
从理论上说固定空白法用“标本＋完全试剂”是最好的办法，此法可以扣除各种因素的误差，如试剂、比色杯等，这也是在自动生化仪应用较多的方法，而用手工法是不易做到的。动态空白仅用于少数试剂不稳定方法，如以固红B测天门冬氨酸转氨酶。
二、主要实验参数的选择（设置）
一般自动分析仪有12个主要数据，即波长、温度、标本及试剂量、空白时间（Tb）、开始收集实验数据时间（Ti）、实验数据收集窗时间（TW）、实验数据收集完成时间（Td）和最后时间（Tf）、速率时间（Tr）、线性限度（L）、异常吸收率（ABN）、曲线拟合、浓度因素（F）。这些参数都是通过方法学的研究之后，根据反应的具体情况加以确定的。
（一）波长
根据分光亮度计的光吸收曲线或者一个比色杯不同波长的反应曲线选择分析波长和空白波长。对快速反应，以光吸收曲线的低凹区波长为空白波长，光吸收曲线中吸亮度最大而较平坦区的波长为分析波长。
（二）温度
一般均选用30℃。
（三）样品量及试剂量
可根据手工法按比例缩减或者重新设计。要考虑到检测灵敏度、线性范围，尽可能将样品稀释倍数大些，以降低样品中其它成分的影响。
（四）分析时间的确定
用高、中、低浓度的标准液进行实验用研究模式，进行酶促反应时间曲线或反应速度时间曲线的观察，根据吸收率动态变化的具体数据，确定有关的分析时间。
⒈Tb 终点法，吸光度上升型，一般选择反应尚示开始而试剂和样品已充分混合均匀，一般定为4秒。动态法的Tb＝Ti。
⒉Ti 终点法选择反应接近平衡期，动态法则选择接近进入线性期。这个参数不很严格。如果Ti定的太早，过多的不符合要求的数据点将舍弃。Ti定的太晚，数据收集时间就要延长，在动态法还可能使底物耗尽的发生机会增多。在终点法Ti大致定于Tf的70％或接近于反应完全时，动态法确定Ti时，主要考虑避开酶反应的延迟期以及试剂和样品混合后温度不平衡期。
⒊TW 根据高、中、低浓度标准液反应速度时间曲线加以确定。要求各标准液的吸光度变化在该时间内均在线性判断标准范围内。终点法一般为4-10秒。在动态法中，为了使反应不出现未反应（NR）的标志，在Tb与Tf之间至少有8mA的吸收率变化。在快速反应时，TW从30秒开始，按10秒向上递增。在慢反应可达120秒。TW不应太长，否则可以偏离线性，也减低工作效率。
⒋Tr Tr值的大小对方法的精密度有较显著的影响。为了保证方法的精密度，使△A＞1.0mA是必要的。如Tr时间短，△A太小，测定方法的精密度就降低。一般情况下，Tr定为20-60秒。在现有程序中，是以正常低值标本的△A＞1mA来决定Tr值。如ALT测定，正常低值为7u/L，Tr＝7u/L/2.57＝2.7mA/60秒，30秒＝1.35mA，故选30秒为Tr时间。
（五）线性判断标准（线性限L）
指在数据收集窗时间内吸收率变化的允许范围。作为终点法，从理论上讲，化学反应达到平衡（终点），吸光度应该稳定不变，也就是说，在TW内吸收率变化应该是零，即线性判断标准应该定为零。在实际中，由于信号有一定的飘移，更主要是测定要求快速，是在反应还没真正到达终点时进行测定，加上自动分析仪检测的灵敏度大多较高，精度可达到0.1mA，所以在TW期间的吸收率会有一定的波动。不同的化学反应或酶促反应，吸光度变化程度不一。要根据实验结果选择一个适当的吸光度变化范围作为线性判断标准，以此来判定反应是否达到了平衡。这个标准值如果定的太小，反应也很难达到要求的标准，出现非线性的机会太多，或者要延长观测时间，降低工作效率，这就不符合快速分析的要求。相反，这个线性判断标准定的太大，就失去了判断线性的意义，出现反应根本没有达到终点就错误地判为达到标准，影响测定结果的可靠性。在终点法中，L单位是mA/2秒，大多选用1.0mA/2秒。如出现反应不完全，可按0.5mA顺序增加。在动态法中，L单位是mA/秒，一般从0.1mA/秒开始，如果试验结果出现非线性（NL）情况多，可以增大，按0.01mA递增，但不可超过0.1mA。
（六）异常吸收率限度
这一参数主要根据每个方法实验测定的线性范围来确定。即用吸光率作为纵轴，标准液浓度为横轴，绘制标准曲线。这个线性段向非线性段转折拐点的相应吸收率值即为异常吸收率限度。终点法吸收率超过此值被标志为超出限度（XL）。在动态法中，试剂空白的吸收率超过ABN，ABN被标志为试剂吸收率异常（AB），测定杯的吸收率超过ABN时，ABN被标志为底物耗尽（EX）。
三、仪器室条件及仪器操作
（一）仪器室条件
⒈接入仪器室的电源线应大于仪器及室内电器所指定的安培容量。
⒉电压不稳定或低于额定电压的地区需加装大于指定功率的电压稳压器。
⒊经常停电地区可装大于指定功率的不间断电源，电源的工作时间任选。
⒋应安装空调器以保持恒温与无尘。空调器的制冷量应大于仪器的产热量，室温波动每分钟应不大于1.33℃。试验温度对室温是有要求的，各型号仪器要求不一，一般30℃试验的室温是18-25℃，37℃试验的室温要求是18-30℃。
（二）仪器操作
各种型号的仪器都有规定的日常操作程序，应按照说明书要求进行。
临床生化方法的选择、建立和评价，是临床生化质量控制的重要基础工作，它们之间的关系可用图20-1表示。
本章内容主要指光谱分析方法的选择、建立和评价，对其它分析方法也有参考价值。其中所述评价系统适用于常规分析方法的评价，在评价试剂盒时也可供参考。
图20-1 方法选择、建立与评价之间的关系
一、方法和标准品的分级
（一）方法的分级
临床生化成分的测定方法很多，根据其准确度与精密度的不同可以分为三级。
⒈决定性方法（definitive method）是指准确度最高，系统误差最小，经过详细的研究，没有发现产生误差的原因或在某些方面不够明确的方法，测定结果为“确定值”，与“真值”最接近。由于技术要求太高，费用昂贵，不直接用于鉴定常规方法的准确性，只用于发展及评价参考方法和标准品。
⒉参考方法（reference method）是指准确度与精密度已经充分证实的分析方法，干扰因素少，系统误差很小，与重复测定的随机误差相比可以忽略不计，有适当的灵敏度、特异性、直线性及较宽的分析范围。这类方法应在条件优越的实验室中应经常使用。但它主要应用于鉴定常规方法，评价其误差大小，干扰因素，并决定其是否可以被接受。它也用于鉴定二级标准品，为质控血清定值，也可用于评价商品试剂盒等。
⒊常规方法（routine method）常规方法的性能指标符合临床或其它目的需要，有适当的分析范围，而且经济实用。所谓偏差已知的方法是指准确度已经确定的方法，其准确度不明者称为偏差未知的方法。常规方法在作出评价以后，经有关学术组织认可，可以作为推荐方法。
临床化学方法之间关系可见图20-2。
图20-2 临床化学方法的关系图
（二）标准品的分级
国际标准化委员会将标准品（参考物）的定义暂定为：它的一种或几种物理或化学性质已经充分确定，被用于校正仪器或证实一种测定方法的物质，并将其分成三级。
⒈一级标准品一级标准品
（原级参考物）是已经确定的稳定而均一的物质，它的数值已由决定性方法确定，或由高度准确的若干方法确定，所含杂质也已经定量。它可用于校正决定性方法，评价及校正参考方法以及为“二级标准品”定值。一级标准品都有证书，在美国由国家标准局（NBS）发给合格证书，并指明它的性质和有关数据。
⒉二级标准品二级标准品（次级标准品）或是纯溶液（水或有机溶剂的溶液），或存在于相似基质中。这类标准品可由实验室自己配制或为商品，其中有关物质的量由参考方法定值或用一级标准品比较而确定，主要用于常规方法的标化或为控制物定值。
⒊控制物控制物有冻干的或溶液，可以用适当的标准品（一级或二级）以参考方法定值，用于质量控制，不用于标化（除经准确定值者）。
二、方法选择的要求
国际临床化学协会（IFCC）提出：常规方法应具有实用性和可靠性两方面的性能指标，至于某一项具体分析方法所应具有的性能标准，可由临床化学家根据采用这一试验的目的决定。
（一）实用性
一般应具备：①微量快速能便于急诊，适合成套项目分析。②费用低廉，包括劳动力与试剂、设备及一般管理费用等。③方法简便。④应用安全可靠。
（二）可靠性
一般具有较高的精密度和准确度，以及较大的检测能力。①精密度，变异系数（CV％）一般应小于5％。②准确度与特异性，准确度是指测定值与“真值”的符合程度。一般偏差系数（CB）应小于5％。特异性是指只对待测物质起化学反应，不与其它结构类似的化合物发生反应。③检测能力，即“检测限度”，或“检出限”。检出限通常是指能与适当的“空白”读数相区别的待测物的最小值。
三、方法选择的步骤
（一）广泛查阅文献
根据方法选择的要求对已发表的各种方法进行比较与检验，确定哪些方法有充分的科学根据及真实的使用价值。必须仔细分析各种方法的特点，选择适合于本实验室具体条件的方法，并且要判断所选方法能否满足本室工作的需要。如果文章中没有写上方法的有关性能资料或引用文献中的有关论述，则不应轻易采用。
（二）选定候选方法
经初步选定的方法称为候选方法。候选方法确定后，应该写出该法的原理与参考文献，所用仪器、试剂的来源、牌号、纯度（或配套试剂盒），标本收集要求，详细的操作步骤，标准曲线和结果计算，文献中列出的性能指标，参考值与参考范围，以及其它应注意的事项与安全防护措施等。
（三）进行初步试验
为了实用的目的，初试应该包括①标准曲线及其重复性；②质控血清或新鲜标本的重复试验；③分析待测物浓度不同的标本，与公认的参考方法的测定值作对比；④要有足够的试验证明仪器与试剂能符合要求。这些初试工作有希望揭露明显的问题。例如未曾预料的困难或误差来源等。初试的特殊目的是使分析工作者熟悉有关技术；掌握各分析步骤的特性；操作是否可以改进或简化；初试所得到的一切资料用于确定是否有必要作进一步研究，如需要和技术上的某些修改，应在评价实验之前作好。
一、方法建立的原理确定
临床生化方法按其传统分类可分为光谱法、层析法、电泳法、酶法、电化学法、分子生物学和免疫化学法等，这些方法的建立首先要根据其技术的原理（详见前面有关章节）和被测物质的物理化学性质来确定其方法建立的原理，例如亮度法测定的对象是各种有色物质，有色物质溶液的颜色深浅与其浓度有一定的关系，浓度大时色深，浓度小时色浅，比较颜色的深浅即可测知待测物质的浓度。为此，首先要知道待测物质本身是否有色，若本身无色，能与何种物质在什么条件下呈色，弄清后即可与一已知浓度的标准品作比较，然后分别测出两者的吸亮度，从郎伯-比耳定律可得知：
由于分析的物质相同，处理也一样，故K值相同，再因为测定时用同样比色皿（L1＝L2），所以光度法中测得未知液与标准液吸光度的比值就等于其浓度的比值。（A1/A2＝C1/C2）。如C1为未知物浓度，则可得到计算公式如下：
C1＝A1×C2/A2
只要再乘以测定时标本的稀释倍数，即为通常光度法测定的通用的计算公式，但此公式只有在测定时空白管为零的条件下才适用。
二、方法建立时的条件选择
在方法建立的原理确定后，尚需根据其原理来选择合适的条件，以保证所建的方法可靠。下面以亮度法为例介绍其条件选择的主要环节。颜色反应是亮度分析的基础，因此，用作亮度测定的颜色反应至少要具备以下几条：反应有较高的特异性，从而干扰小；反应产生的有色物质吸光系数要大，大者灵敏度高；有色产物的离解度要小，小则稳定；此外，还要求有色产物有恒定的组成成分，使产生的颜色稳定。由于影响颜色反应的因素很多，如温度、pH、试剂浓度、反应的时间等等。这些因素在建立新方法时都要逐项试验，确定最佳实验条件。
（一）选择合适的吸收光谱
实际上就是测定颜色反应产生的光吸收曲线。方法是在整个可见光区（400-700nm）以10nm（在接近最大吸收波长范围还应再细分）间隔。分为十几个点测定其在不同波长时的吸光度，然后以吸光度为纵坐标，波长为横坐标绘成光吸收曲线。在条件许可的情况下，应采用双光束分光光度计在可见光区进行波长扫描，结果较为可靠。同时，还应以同法分别测定其空白液和标准物颜色产物的吸收曲线。测定光吸收曲线的目的是找出最大吸收波长，作为光度法波长选择的依据。因为在最大吸收波长测定，可获得最大灵敏度，且能更符合比耳定律。然而在实际使用中，不能单纯考虑灵敏度高，还要考虑在测定浓度范围能否符合比耳定律，并能在光度计准确区域内（吸光度0.2-0.85之间）读出读数。有时由于测定的最大吸收波长并不是所要测定物质的特性吸收波长，即同时存在具有相似最大吸收的干扰物质，为了保证实验的特异性，常改用特有而非最大吸收波长进行测定。例如用磷钼酸测定血糖，选用波长420nm，溶液对此波长的吸收比其它波长光线的吸收都低，其目的是使参考值有一个较低的吸收，这样可允许在相同情况下对高出参考值的血糖也能得到准确的读数。因为在这项测定中，高血糖是常见的变化方向。
（二）测定方法适用的浓度范围
根据光吸收定律，溶液的吸光度应与溶液的浓度成正比。但由于有色物质的电离、水解、缔合等原因当溶液稀释或增浓时，有色物质颜色的深浅并不按比例降低或增高，因而也就不符合光吸收定律。测定方法适用的浓度范围是指分析的浓度范围在直线线性段，浓度与吸光度之比为一常数，此时直线上任何一点的斜率tanθ相等，即：
tanθ＝A1/C1＝A2/C2＝A3/C3＝……＝An/Cn＝K
此处K即为校正常数，可用于结果计算。
通常稀溶液都是符合比耳定律的，但在浓度过高和过低时往往都不呈直线，说明低浓度部分亦有仪器的灵敏度和方法的检测能力限制，所以，具体的测定就宜选择在直线段浓度范围内进行。以此还可用于确定标本的用量，使具有临床意义的标本测定结果都落在直线范围内。
（三）观察影响颜色反应的因素
影响颜色反应的主要因素有：溶液pH的影响、杂质的影响、反应的温度和时间、以及颜色的稳定性等。这些都是光度法测定误差的主要来源。都需要通过实验来观察并控制在一个适宜的范围内。从而保证方法的准确性和精密性。
⒈溶液pH的影响有些溶液的颜色对pH值的改变非常灵敏。例如白蛋白在pH4左右可与溴甲酚绿结合后由黄色变成绿色，绿色的深浅与白蛋白浓度成正比，但是溴甲酚绿本身是一种pH指示剂，当pH5.4时即由黄色转变成绿色，在pH3.8时又由绿色变为黄色。在白蛋白与溴甲酚绿结合颜色反应中，如pH控制不好就很容易出现误差，又如每种酶都有各自的最适pH，酶促反应中，只有在其最适pH时才能发挥充分的催化活性。因此，在建立方法时可在不同pH值条件下（其它条件不变）令其反应，以观察颜色反应的吸光度变化，从而选择合适的pH值范围来保证颜色反应，以求较高的灵敏度和较好的线性。有时还需用相应的pH缓冲液来维持反应的pH，以利颜色反应的正常进行。
⒉杂质的影响由于临床生化标本中除含待测物质外，还含有许多非测定物质，成分十分复杂，它们有的可与有色产物作用，使产生的颜色逐渐退去，有的与待测物质相类似，也能缓慢地与显色试剂生成有色化合物或沉淀，有的本身是有色的等，都会影响被测物溶液的颜色。试验方法是将各种可疑物质的纯溶液作标本单独进行测定，如产生颜色反应，这说明该方法的特异性不高。如果将待测物质混入可疑物质作标本测定，改变了被测物质与试剂间的反应，这是干扰（具体方法见第三节）。为此就需要进一步改进方法，或设立标本空白，或将标本作适当处理，除去干扰物，或加入合适的干扰物掩蔽剂等，以提高方法的特异性。
⒊反应的温度和时间有些有色物质能迅速反应生成，另一些有色物质须经过相当长时间后反应才能完全。提高反应的温度可以加速化学反应，缩短反应的时间。因此，如果在不恰当的温度和时间内进行比色，将会造成相当大的误差。这可以在不同的温度下（如设定25℃，30℃，37℃）令其反应，通过检测吸光度来观察各自反应终点时间（一般达到反应终点，随后测定的吸光度不再变化），以选定适宜临床应用的反应最佳温度和时间。
⒋稳定性试验待测物质经显色反应产生的有色物稳定与否，关系到测定结果的可靠性。某些有色物质虽然生成很快，但却不太稳定，放置后色泽会逐步消退或起变化，有些干扰物虽不能与被测物质同时发生颜色反应，但当放置一段时间后也能缓慢地与试剂显色，使溶液颜色加深。因此，在方法建立的同时作稳定性试验很有必要。试验的方法是用被测标本、标准溶液、空白溶液按方法要求进行显色反应后，即刻及室温放置不同时间，分别测定其吸光度，根据其吸光度的变化确定方法稳定的时间范围。一般要求有色溶液能稳定二小时以上就能满足临床应用的需要。必要时还要加以注明。
三、方法建立后的临床观察
方法建立的目的是为了更好地应用于临床，为疾病的诊断和治疗提供可靠的依据。因此，在方法建立后必须作临床观察试验。
（一）正常参考值试验
制定参考值（referencevalues）时，首先要阅读有关资料，依照经典的文献作为研究设计的依据，使设计尽量合理，结果令人信服，有实用价值。1978年，国际临床化学委员会下属的“参考值”理论专家组发表专门文件，推荐出一套有关参考值的概念、定义、建立和使用方案。参考值的建立应包括参考个体、参考人群、参考标本、参考值、参考分布、参考限和参考区间。它们之间的关系如下：
具体试验是对选定的一定人群中的健康人，按性别、年龄等分组，每组至少100人，应用所建立方法测定，如所得某体液成分的结果呈正态分析，经统计处理求出均值（X）和标准差（S），然后将X±2S定为正常参考范围。但如胆红素、铁、尿素及碱性磷酸酶等，常呈不对称的偏态分布，需经适当的数据处理，使之接近正态分布的形式，这样就可参照正态分析数据一样来对待。常用的有对数转换法，使每一个数值转换为相应的对数值，用其对数值作图，若呈正态分布，则利用此对数值计算X和S值，最后将结果转换回为相应的自然对数值，求得均值及参考值的上限和下限。确定的参考值要求符合以前的调查报告。
（二）临床病例观察试验
临床病例观察的目的是指出所建方法的某项试验，对特定疾病的预示值（PV）。预示值为一项诊断试验确定或排队某疾病存在与否的诊断概率。预示值尚可分为阳性预示值（PV+）和阴性预示值（PV－）它们分别表示确定诊断或排除诊断的把握有多大，是诊断试验的评价指标。诊断试验评价指标除预示值外，还有诊断特异性、诊断灵敏度和准确度。这些指标都与疾病的发生率有关。现将有关名词的概念，作简要地介绍。
⒈真阳性者（TP）经试验而被正确分类的患者的数目。
⒉假阳性者（FP）经试验而被错误分类的无病试者的数目。
⒊真阴性者（TN）经试验而被正确分类的无病试者的数目。
⒋假阴性者（FN）经试验而被错误分类的患病试者的数目。
⒌诊断灵敏度 患病试者的阳性百分率。
⒍诊断特异性 无病试者的阴性百分率。
⒎阳性结果的预示值（PV＋）阳性结果中真阳性者的百分数。
⒏阴性结果的预示值（PV－）阴性结果中真阴性者的百分数。
⒐实验的总有效率所有实验结果中正确结果的百分数。
在临床应用中，主要以阳性结果的预示值观察实验结果的使用价值。但在固定参考范围的条件下，对不同发病率的人群进行相同指标检测时，所得到的预示值会有很大变化。例如用某方法对某专科病房检测100个标本，发病率为50％，方法诊断灵敏度为95％，诊断特异性为95％。由此数据可知：
TP＝50×95％＝47.5人；FN＝50－47.5＝2.5人；
TN＝50×95％＝47.5人；FP＝50－47.5＝2.5人；
TP＋FP＝50人，TN＋FN＝50人
临床对该检测方法的运用满意。经同样方法用于普查，调查某地区发病率为5％，检测1000例中，950人为非病人，50人为病人。
TP＝50×95％＝47.5人；FN＝50－47.5＝2.5人；
TN＝950×95％＝902.5人；FP＝950－902.5＝47.5人；
PV＋＝47.5/95×100％＝50％
PV－＝902.5/905×100％＝99.7％
总有效率＝(47.5+902.5)/(95+905)×100％＝95％
临床认为这个检验方法使用价值不高，因为在普查中假阳性率占50％，给进一步诊断带来困难。如可能可调整参数值范围来提高方法的使用价值。一般认为，用于过筛实验的分析方法，希望有最高的灵敏度；用于确诊实验的分析方法，必须有高特异性。
（三）质量控制观察
方法是用控制物随临床常规标本一起用所建方法测定，连续测定一个月。以观察在实验室常规应用中的准确性和精密性，判断是否满足临床应用的要求，具体做法见第二十一章。
一、评价实验与分析误差类型的关系
方法学评价（evalution of methodology）的基本内容是通过实验途径，测定并评价方法的精密度与准确度，在实验中测定的是不精密度与不准确度，不伦精密度还是准确度，强调的都是误差，评价实验的过程就是对误差的测定。因此，方法评价的各项实验是配合检测各种类型的分析误差而设计的，表20-1表示了它们之间的关系。
表20-1 评价实验与分析误差类型的关系
| 分析误差的类型 | 评价实验 | |
| 初步试验 | 最后试验 | |
| 偶然误差 | 批内（或天内）重复性 | 天间重复性 |
| 恒定误差 | 干扰 | 与比较方法对比 |
| 比例误差 | 回收 | |
二、实验方法的评价
（一）重复性试验
目的在于考察候选方法的随机误差，重复性试验的方法是对同一材料分成数份试验样品，进行多次分析测定。
⒈试验形式与方法 ①批内重复性试验：可以用同一份标本在相当短的时间内，按规定的操作方法，在较稳定的条件下，作多次（一般为20次）重复性测定。计算其X、S与CV。不同性质的分析对CV值的要求不同，一般应小于5％，精密的分析或多次平行测定，要求小于2％。②天内重复性试验：在一天内对一个或数个标本作数批重复测定，其它条件和批内相同，但因在一天内重复测定几批，所受影响因素要比批内多，所得的CV值可能比批内大一些。③天间重复性试验：将同一标本每天一次随机插入常规标本中测定，连续20个工作日，这样得到的CV值比上述批内与天内大，能反映实际工作的情况。④病人标本的平行双份测定：如不易得到含有合适基质的稳定样品（如作血液pH的重复性测定的标本），可采用病人标本的双份测定来代替重复性试验，选择一批病人标本（20至100份），待测物浓度应在实验方法的分析范围内，有高有低；记录标本的特性，如有某种药物、混浊、溶血或有尿毒症等，可影响其准确性。可作一批或几批分析，但每一标本都平行做两份，用双份分析结果之差（d）来计算S（∑d/2N）作为不精密度的指标。
⒉分析样品的选择作重复性试验的样品，应用标准液、控制物溶液、病人标本或混合血清均可，视其用途而定。作批内重复性试验，用标准液可以得到各种不同浓度，较简便，它代表了最好的重复性性能。若结果良好，说明方法操作是适宜的，再进一步用其它样品进行测定。在进行天间重复性试验时，用冻干质控血清较好，因其稳定、方便。其它样品进行测定。在进行天间重复性试验时，用冻干质控血清较好，因其稳定、方便。
⒊分析物浓度的选择进行重复性试验时被测物浓度，宜选择在医学上具有决定性意义的浓度进行试验，因为这种浓度在临床分析实验结果时最有用处。
（二）回收试验
所谓回收即分析方法正确测定加入常规分析样品中的纯分析物的能力。目的是测定比例系统误差，以衡量候选方法的准确度。
⒈方法将被分析的纯品标准液加入病人样品中，成为分析样品，原病人样品加入相同量的无分析物的溶液作基础样品，然后用实验方法分析，两者测定结果的差值为回收量。
⒉回收率计算 以测定血清钙为例说明如下：
⑴样品制备
1)基础样品：血清2ml＋蒸馏水0.1ml；
2)分析样品：血清2ml＋4mmol/L钙标准液0.1ml；
3)分析样品：血清2ml＋25mmol/L钙标准液0.1ml；
⑵计算公式及计算结果
故本例的②③管的加入量分别为：
回收浓度＝分析样品测得浓度－基础样品测得浓度
回收率（％）＝回收浓度/加入浓度×100％
本例结果见表20-2
表20-2 血清钙回收试验结果
| 测得浓度（mmol/L） | 加入浓度（mmol/L） | 回收浓度（mmol/L） | 回收率％ |
| ①1.70 | ― | ― | ― |
| ②1.88 | 0.19 | 0.18 | 94.7 |
| ③2.85 | 1.19 | 1.15 | 96.6 |
| 平均 | 95.7 |
理想的结果期望回收率达到100％，现在平均回收率为95.7％，有4.3％的比例误差，它表明一个含钙真值为2.5mmol/L的标本，若用该方法测定，约为2.39mmol/L（2.5×95.79％），误差为0.11mmol/L（2.5×4.3％）。
⒊注意事项
①准确吸量，因为被分析物的理论值是根据加入标准液体积及原样品的体积计算所得，吸量稍有不准，就会影响结果。因此，选择经过校准的吸管，严格地清洗与干燥，以及按正规要求吸量均很重要。②样品中加入标准液后，总的浓度必须在测定方法的分析范围内，一般须作加入高、中、低不同浓度的回收试验，计算平均回收率。③加入标准液后，最好使实验样品中被测浓度达到医学上具有决定意义的浓度。④加入标准液的体积在整个样品中要少，一般在10％以内。若稀释过大，误差将发生改变，甚至消失。
（三）干扰试验
干扰试验的目的也是用来衡量候选方法的准确度的。在加入一定浓度的干扰物的条件下，形成的是恒定系统误差。干扰物浓度不同，误差大小也不同。
⒈方法基本与回收试验一样，但是加入的是疑有干扰或非特异性反应的物质而不是标准液。以肌酐对葡萄糖测定的干扰试验方法及结果简述如下：
样品制备
1)基础样品：0.9ml血清＋0.1ml蒸馏水。
2)分析样品：0.9ml血清＋0.1ml 442μmol/L肌酐溶液。
3) 分析样品：0.9ml血清＋0.1ml 884μmol/L肌酐溶液。
所有各样品均作双份葡萄糖测定取平均值。加入值的计算同回收试验。分析样品与基础样品两值之差为干扰值。结果如下：
| 葡萄糖测得值 | 加入肌酐值 | 干扰值 |
| 5.55mmol/L | － | － |
| 5.77mmol/L | 442μmol/L | 0.22mmol/L |
| 6.16mmol/L | 884μmol/L | 0.61mmol/L |
结果说明：每88.4μmol/L肌酐约使葡萄糖测定增加0.056mmol/L。在正常人，肌酐约为132μmol/L，将使葡萄糖测定带入约0.11mmol/L的误差，在临床上并无意义。但肌酐病理值可达884-1786μmol/L，对葡萄糖测定引入约0.56-1.11mmol/L误差，就会影响临床应用。
⒉可疑干扰物的浓度加入可疑干扰物的浓度须达到有价值的范围，有可能应达到病理标本的最高浓度值，在确证有影响后应测定在何浓度时，产生的误差在临床上无意义，即确定使分析结果影响临床应用价值的最低可疑物浓度值。
⒊被试验的物质可根据该方法的反应原理，提示出可能的干扰物。一般应考虑的是用胆红素、溶血（血红蛋白）、脂血、防腐剂、抗凝剂等进行试验。但干扰试验有一定的局限性，因为人们只能试验某些物质的影响，还有许多药物和食物成分未经试验，亦不能认为无关。干扰试验也可用比较方法进行，比较方法若为常规方法更应如此，若两个方法具有相同干扰，这种干扰不应作为否定试验方法的理由，试验方法应在其它性能方面较原常规方法为好，从而对检验质量有所提高。
⒋消除干扰的常用方法 ①作空白（对照）试验。一是试剂空白，可以校正标本读数中的试剂部分；另一种是标本空白，用以补偿标本中被测物以外的其它物质的影响。②采用各种物理、化学的方法、分离除去干扰物。③近年来出现的由计算机控制的双波长或多波长检测仪器，在排除干扰因素方面既有效又简便（详见仪器分析有关内容）。
（四）方法比较实验
对比试验用于检测候选方法的系统分析误差，包括比例和恒定两种系统误差在内。如果对适当的数据进行分析，也可提供系统误差的性质究竟是属恒定误差还是比例误差。
⒈方法对一组病人的标本用候选方法和对比方法同时进行分析测定，最后观察两者之间的差异。这是考验候选方法是否可被采用的重要措施。
⒉比较方法的选择在临床生化常规方法评价时，最好选择参考方法作为对比方法。这样在解释结果时，就可把方法间的任何分析误差都可归于候选方法。
⒊注意事项 ①试验样品数：一般作40-100例，包括各种疾病的样品，即包括在常规工作中可能遇到的整个分析范围。选择合适的样品比增加试验样品的数目更为重要。②重复分析：一般每个样品用两种方法各测定一次，最好各测定两次，不是平行测定，而是分两批进行。两种方法及两批测定，须在同一天内，最好是在4小时内进行。③时间间隔：每天测定2-5个样品，约测定20天。④结果的图示：根据实验结果作坐标图，比较方法所得数值为横坐标，候选方法所得数值为纵坐标，用以定性地估计分析误差。进行双份测定时，候选方法的第一次结果与对比方法的第一次结果作图；第二次结果也如此。溶血、脂血、黄疸标本，可在相应的散点上标以H、L、I等符号。每天测定的结果应及时绘于图上，以便及时检查结果，发现问题，对结果有矛盾的样品，可取原样重新测定。
⒋统计处理方法比较试验所得的结果是配对资料，可进行配对资料的统计处理，包括配对t检验、相关和回归分析等。通常都选用相关回归分析方法，因为此法可以计算出所研究浓度范围内任一浓度的系统误差。从回归方程y＝a＋bx中，可显示出候选方法有无系统性误差。这种误差分三类：恒定系统误差与比例系统误差，或两者兼有。回归线的截距a代表恒定误差，回归系数（回归线的斜率）b代表比例误差，相关系数r代表两种方法的相关性是否密切。
实际情况并不简单，X与Y值都有偶然误差存在，b与a只是估计值，需要确定其可信限。在评价一种候选方法时，如果a＝0，b的数值稍偏离1.0，那么这种偏离程度是否小到可以忽略不计，因而使候选方法可以接受。这就需要参考a及b值的变动范围，根据经验判断是否可以适用于临床检验的目的。在方法比较试验中的相关系数r可作为候选方法可否接受的一种指针，但r值随病人标本测定范围的增加而增大，因此，在配对资料分析中，不应片面地根据相关系数r来判断两种方法分析结果的符合程度。
候选方法可否被接受，最后根据评价实验中的误差结果进行归纳，作出判断。West-gard曾经对医学决定水平上的分析误差，采用统计学方法制定出一套判断指标，首先是制定“可允许误差的95％限度”，然后计算各项误差并与其比较，任何一项指标大于可允许误差都不能被接受。
一、方法学性能标准及其制定
（一）性能标准
性能标准（performance standards，PS）也称分析目标，应根据不同的应用目的（筛选、诊断、预后、监测）而异。由允许分析误差（allowableanalyticalerror）和医学决定水平（medical decision level）这两项内容决定。
⒈允许分析误差 用EA表示，它被规定为95％样品的允许误差限度，即95％的病人样品其误差应小于这个限度。
⒉医学决定水平 用Xc表示，临床判断结果具有意义的分析物浓度。
EA和Xc两项内容，就是一个测定方法的性能指标。但对于每一医学决定水平都应规定相应的性能标准，即在一定Xc值下的EA值。以血清葡萄糖测定为例。在Xcl＝2.8mmol/L，Xc2＝6.7mmol/L，Xc3＝8.9mmol/L时，其相应的EA均为0.56mmol/L，而在Xc4＝16.8mmol/L，其EA为1.4mmol/L。
这表示当葡萄糖浓度在2.8mmol/L、6.7mmol/L和8.9mmol/L时，95％的样品具有的误差不得大于0.56mmol/L，而浓度在16.8mmol/L时，95％的样品所具有的误差不得大于1.4mmol/L。这里指的是总误差。
（二）性能标准的制定
制定的性能标准，既应反映临床应用与解释结果的要求，称为医学效用限度（medicalusefulness limits），又应基本符合实验室所能达到的技能状态（state of art）。因此，需要由临床医学家和临床化学家共同研究制定。
⒈根据参考值与参考范围而定的标准这是Tonks于1963年提出的，其公式是：
最大的可允许误差定为±10％，但对某些物质（如酶）则提高到±20％。由于其允许误差以参考范围表示，有临床实用意义，但缺点是参考范围的宽度与试验本身的不精密度有关，一项不精密的方法由于测出的参考范围较宽，以致可制定出较宽的可允许误差限度，就会使一项性能不够好的分析方法的应用合法化。
⒉根据临床观察制定的标准这往往反映参与与制定的医生的经验，综合临床及实验室的意见，提出在医学决定水平上的不精密度标准。还有不准确度及综合不精密度与不准确度的标准。一般说来，在参考范围内的中间及很不正常的水平时，医生允许有较大的变异系数。特别是用于诊断，而不是用于监视疗效的。但在医学决定水平需要最严格的指标。这种方法的缺点是主观成分较大，而且收集临床的意见也很困难，它依赖于临床医生对实验室工作的充分了解。
⒊根据生物学变异制定的不精密度标准生物学变异或称生理变异（CVB）包括个体内变异（CVP）及个体间变异（CVg），也就是通常所说的生理波动。
美国病理学会建议，为了在人群中筛选某些疾病，不精密度（CV）应等于或小于个体内及个体间变异的二分之一（即≤1/2CVB）。对于个别试验，目的在于辅助诊断或监测治疗效果，则CV应小于或等于1/2CVP。但目前文献报告的生物学变异数据不一致，由于这种方法比较好，将来可能会有更多的研究。
⒋根据实验室技能状态制定的标准技能状态是根据技术熟练而且误差最小的一组实验室的数据，计算出在参考范围高限的变异系数作为标准的，这实际上是指当前技术水平所可能达到的技能状态。当然，技能状态有继续进步的趋势，在没有更好的标准以前，技能状态还会继续用作实验室工作性能的标准。对于生物变异相当大的项目，以技能状态作为不精密度的标准更为合适。
二、使用单值判断指标判断
单值判断指标（single-value criteria）较简单，在评价过程中用于初步估量。
⒈计算公式 单值判断指标的计算公式见表20-3
表20-3 单值判断指标
| 误差类别 | 判断指标 | 备注 |
| 随机误差（RE） | 1.96TM＜EA Xc |
STM＝重复试验的标准差 |
| 比例误差（PE） | (｜R-100｜)（棧?/FONT>EA 100 |
R＝平均回收率 |
| 恒定误差（CE） | ｜偏差｜＜EA | 由干扰试验测出 |
| 系统误差（SE） | ｜(a＋bXc)-Xc｜＜EA | 对比试验回归方程 |
| 总误差(TE＝RE＋SE) | 1.96STM＋｜(a＋bXc)｜＜EA | 包括偶然及系统误差 |
⒉结果判断单值判断指标是可接受性能的估计指标。对前述各项实验
结果经计算得到各项误差值后，分别与EA值比较，必须都比EA小，该方法才初步判断为可接受，否则为不可接受，可改进分析方法减少误差或排除该方法。
判断举例：用单值判断指标判断某法测定血肌酐的结果：
设Xc＝176.8μmol/L时，EA＝35.4μmol/L，
⑴偶然误差
重复性误差：n＝20，X＝176.8μmol/L，STM＝3.536μmol/L
判断：1.96STM＝1.96×3.563μmol/L＝6.93μmol/L，因RE＜EA，偶然误差可以接受。
⑵系统误差：回归方程：n＝50，a＝－0.98，b＝0.925，Y＝－0.98＋0.925X。
SE＝｜(a＋bXc)－Xc｜＝｜（－0.98＋0.925×176.8）－176.8｜＝14.24μmol/L
判断：｜（a＋bXc）Xc｜＜EA，系统误差可以接受。
⑶总误差：RE＝6.93μmol/L，SE＝14.24μmol/L
判断：RE＋SE＝6.93＋14.24＝21.17μmol/L＜EA，总误差可以接受，故该方法为可接受。
对于一个判断为不能接受的方法，为了减少某一误差而作了改进，则各个评价试验都须重新进行做。
单值判断指标虽简单，但主要问题是各项试验的样品数都较小，使测定值极可能是分析误差的不可靠测量，最后使实验估计发生错误。因此，只有在假设所有实验结果是绝对正确的前提下，才能进行上述计算。为了在适当的样品数下，能以最小的代价取得实验误差测定的最大可靠性，可用可信区间判断指标。
三、使用可信区间判断指标判断
可信区间判断指标比较复杂，但能对方法性能提供更客观的决定，起最后判断作用。
⒈90％可信区间，可信上限及可信下限统计学的规律说明，每种测定结果的可靠性与测定次数有关，次数愈多，结果反映真实性愈强；但实际上，不可能进行大量的测定。在统计学中为了估量分析误差的不确定性，对于每一误差可计算其可信区间，用可信上限与可信下限代替单值的估量，EU为误差的可信上限，EL为误差的可信下限。West-gard推荐用90％的可信区间，这样，EU将是误差单侧的95％上限，用此判断候选方法的可接受性比较可靠。假如，EU＜EA，则方法性能为可接受；假如EL＞EA，则方法必须改进，以减少误差，否则排除。假如EU＞EA，但EL＜EA，说明仅有的数据不足以作出任何有关可接受性的结论，还需继续实验以收集更多的数据，以便对分析误差作出较好的估量。可信区间判断指标见表20-4
表20-4 可信区间判断指标
这些指标在形式上与表20-3的单值判断指标相似，最明显的差别是对每一类型误差用两个判断指标，其一是判断可接受性，其二是判断排除。对RE、PE及CE的判断指标，仅用了误差估量的上限和下限。SE和TE的判断指标较为复杂，引入了一个新的术语“W”。
W是回归线可信区间的宽度（与给定的Xc相对应的Yc值范围），对于一给定的Xc，Yc的上下可信限由方程（a＋bXc）±W计算得到。W计算式如下：
W＝t(SY/X)〔1/N＋(Xc－X)2/∑(Xi－X)2〕1/2
W的大小取决于选择的百分区间（这里是90％），即和选择的值有关（这里选双侧）。W也和回归线标准差SY/x成正比关系，SY/x直接反应方法对比数据的不确定性。中括号内的式子表明，在N很大，Xc＝X，W很小，若Xc无论在哪一方向逐渐偏高X，则（Xc－X）之差增大，W也增大。如图20-3表示。
图20-3 回归线的可信区间
⒉计算举例这里介绍某血清钙测定方法的各种评价实验数据，用五个例子概括说明。需指出的是，作为误差估量的上下限，必须具有相同的代数符号，否则下限应取作零。
例一用可信区间判断指标确定偶然误差（RE）是否为可接受。
由重复性试验获得：N＝21，Y＝11.0mmol/L，STM＝0.08mmol/L
假设Xc＝11.0mmol/L时，EA＝0.5mmol/L，
⑴计算STN的95％可信限
STMU＝STM×fu STML＝STM×fL
由表20-5查自由度
df＝(N－1)fU、fL的值（f为计算因素）
现N＝21，df＝20，fU＝1.358，fL＝0.7979
则：STMU＝0.08×1.358＝0.11mmol/L
STML＝0.08×0.7979＝0.06mmol/L
表20-5计算单侧可信限（95％）的f值
| df | fu | fl |
| 10 | 1.593 | 0.7391 |
| 20 | 1.358 | 0.7979 |
| 30 | 1.274 | 0.8279 |
| 40 | 1.228 | 0.8480 |
| 60 | 1.179 | 0.8710 |
| 80 | 1.151 | 0.8860 |
| 100 | 1.133 | 0.8968 |
⑵计算REU和REL
REU＝1.96STMU＝1.96×0.11＝0.22mmol/L
REL＝1.96STML＝1.96×0.06＝0.12mmol/L
⑶将以上估量值与EA比较
REU＜EA即0.22＜0.5。因此，由重复性试验所得的RE是在可接受的低水平上。
例二由可信区间判断指标判断比例误差（PE）是否为可接受。
回收试验的数据：N＝9，R＝99、98、98、99、100、98、99、100（％）
设：Xc＝11.0mmol/L，EA＝0.5mmol/L
⑴计算平均回收率R及标准误SR：
R＝98.9％ SR＝0.78％
⑵计算平均回收率的标准误SR：
表20-6 90％可信区间或95％可信限的t值
| df | T | df | t |
| 3 | 2.35 | 12 | 1.78 |
| 4 | 2.13 | 14 | 1.76 |
| 5 | 2.02 | 16 | 1.75 |
| 6 | 1.94 | 20 | 1.72 |
| 7 | 1.90 | 25 | 1.71 |
| 8 | 1.86 | 30 | 1.70 |
| 9 | 1.83 | 40 | 1.68 |
| 10 | 1.81 | 120 | 1.66 |
⑶计算R的95％可信限
RU＝R＋t×SR RL＝R－t×SR
从表20-6 t值表中查t值
现N＝9，df＝8，t0.01＝1.86
则：RU＝98.9＋1.86×0.26
98.9＋0.48＝99.4％
RL＝98.9－1.86×0.26
＝98.9－0.484＝98.42％
⑷计算％PE的上下可信限：
％PEU＝|RU或L－100|U
％PEL＝|RU或L－100|L
％PEU＝|98.4－100|＝1.6％
％PEL＝|99.4－100|＝0.6％
⑸将％PEU及％PEL与Xc相乘，换算成浓度单位％PEU及％PEL。
PEU＝％PEU·Xc＝1.6％×11.0mmol/L＝0.18mmol/L
PEL＝％PEL×Xc＝0.6×11.0mmol/L＝0.07mmol/L
⑹将以上测得的PRU值与EA作比较
PEU＜EA即0.18＜0.5。因此，作为回收试验测得的PE值是在可接受的低水平上。
例三用可信区间判断指标确定恒定误差（CE）是否为可接受。
由干扰试验得到下列数据表20-7
表20-7 干扰试验结果
| 标本号 | 测得浓度mmol/L | 干扰值 Mmol/L |
|
| 未加干扰物 | 加干扰物 | ||
| 1 | 10.72 | 10.69 | －0.03 |
| 2 | 8.56 | 8.51 | －0.05 |
| 3 | 11.60 | 11.58 | －0.02 |
| 4 | 6.45 | 6.41 | －0.04 |
| 5 | 14.12 | 14.08 | －0.04 |
| 6 | 12.30 | 12.27 | －0.03 |
| 7 | 9.75 | 9.72 | －0.03 |
| 8 | 5.84 | 5.82 | －0.02 |
| 9 | 10.41 | 10.38 | －0.03 |
设：Xc＝11.0mmol/L，EA＝0.5mmol/L
⑴计算平均干扰值d及标准差Sd：
d＝0.032mmol/L，Sd＝0.0097mmol/L
⑵计算CE的95％可信限：
从表20-6查得当N＝9，df＝8，t0.01＝1.86
⑶将以上CE值与EA作比较
CEU＜EA即0.038＜0.5，因此，通过试验测得的CE值，在可接受的水平。
例四用可信区间判断指标确定系统误差（SE）是否为可接受。
由方法对比试验得到下列数据：
N＝109，a＝0.25mmol/L，b＝0.981，SY/x＝0.351mmol/L，X＝8.42mmol/L，Sx＝5.42mmol/L
设：Xc＝11.0mmol/L时，EA＝0.5mmol/L
⑴计算相当于Xc的候选方法Yc值：
Yc＝a＋bXc＝0.25＋0.981×11.0＝11.04mmol/L
⑵计算Yc的可信区间宽度W：
W＝t(SY/x)〔1/N＋(Xc－X)2/∑(Xi－X)2〕1/2〕
查表20-6，N＝109，df用120，t＝1.66
从Sx式中计算∑(Xi－X)2，即
则∑(Xi－X)2＝Sx2(N－1)，因此
∑(Xi－X)2＝(5.42)2(109－1)＝3172.65
将各数据代入得
W＝1.66(0.351)〔1/109＋(11.0－8.42)2/3172.65〕1/2＝0.062mmol/L
⑶计算SEU及SEL：
SEU＝|(Yc±W)－Xc|U＝|(11.04＋0.062)－11.0|U＝0.102mmol/L
SEL＝|(Yc±W)－Xc|L＝|(11.04－0.062)－11.0|L＝0.022mmol/L
注意：用＋W还是用－W，需视能获得较大的SEU值而定。
⑷将以上SEU值与EA值作比较
SEU＜EA，即0.102＜0.5，因此，从方法对比试验中测得的系统误差在可接受的低水平。
例五 用可信区间判断指标确定总误差（TE）是否不为可接受。
用例一重复试验和例四方法比较试验所得RE及SE计算总误差。
设：Xc＝11.0mmol/L时，EA＝0.5mmol/L，
⑴计算TEU：
⑵计算TEL：
⑶将以上TE值和EA值作比较
TEU＜EA，即0.27＜0.5，因此，TE值已足以小到可接受的水平。
如果候选方法被得出可接受性的结论，那么接着就要进行评价后实施；最后进入方法应用阶段。不要以为一经评价合格的方法就可产生高质量的结果，还须建立质控系统，以便随时发现合格的方法在实施过程中出现的问题。要善于发现其中还存在的不足并进一步研究解决使其日臻完善。
评价实验完成以后，应该写出书面报告，报告中除了叙述操作方法（包括试剂配制与所需器材）以外，应着重写出所选方法的各项性能指标，要特别重视实验数据的科学整理与客观陈述。评价实验的结果也可整理成论文在专业杂志上发表。
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