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英文题目：Unmasking viral sequences by metagenomic next-generation sequencing in adult human blood samples during steroid-refractory/dependent graft-versus-host disease

中文题目：在类固醇难治性/依赖性移植物抗宿主病期间，通过宏基因组测序揭示成人血液样本中的病毒序列

发表期刊：Microbiome IF：11.607

见刊时间：2021.01.24

发表单位：瑞士日内瓦大学医院传染病部与检验医学部病毒学实验室

材料与方法

这项观察性研究在瑞士日内瓦大学医院(HUG)进行。研究方案已获日内瓦州伦理委员会批准。在2016年1月1日至2018年12月31日于HUG接受异体造血干细胞移植并发展为类固醇难愈/依赖的急性或慢性移植物抗宿主病的成年患者中，根据是否发生感染建立了GvHD异体造血干细胞移植患者单中心感染性疾病队列。所有纳入患者在入组前均提供了知情同意书。唯一的排除标准是没有知情同意书。在异基因造血干细胞移植后的临床管理期间前瞻性地收集血浆样本，并保存于HUG病毒学实验室。对每个患者在强化类固醇治疗或二线GvHD治疗期间收集的血浆样本进行mNGS分析。

研究成果

1、mNGS病毒鉴定结果及验证性分析

该研究共纳入了25例成人GvHD异体造血干细胞移植受者，强化免疫抑制的中位持续时间为5.1个月， 25例患者中有22例接受鲁索利替尼（Ruxolitinib）治疗。在撰写本文时，已有15例患者死亡，其中9例被认为与GvHD相关。 除患者Ge18外，mNGS在其他24例患者中均鉴定到病毒核苷酸序列。同时在16例患者中，检测到≥3种不同的病毒种类（图1）。

图1. 25例患者血浆样本中mNGS鉴定到的病毒网格图

图2展示了每种病毒的流行性。Anelloviridae（torque teno virus(TTV), torque teno minivirus(TTMV) and torque teno midivirus(TTMD)）和human pegivirus-1(HPgV-1)分别在24/25例和9/25例患者中流行。检测到的DNA病毒包括BK多瘤病毒(BKPyV)(7/25)、CMV(5/25)、JC多瘤病毒(JCPyV)(4/25)，以及单纯疱疹病毒1 (HSV-1)、EBV、乙型肝炎病毒(HBV)、bufavirus, cutavirus和HPyV-6/7，各检出1次(1/25)。除HPgV-1外，RNA病毒的流行率低于DNA病毒，分别为HAstV （Mamastrovirus 1、6）和风疹病毒，均检出2次(2/25)，戊型肝炎病毒(HEV)和乌苏图病毒(Usutu virus )均检出1次(1/ 25)。重新分析没有发现其他相关序列。 有趣的是，在DNA和RNA流程中均检测到TTV(11/24)、CMV(3/5)、EBV(1/1)和HBV(1/1)的序列，表明病毒复制活跃。

图2. 25例患者血浆样本中mNGS鉴定到的病毒流行率

2、临床常见的病毒

在96%和36%的患者样本中鉴定到了Anelloviridae和HPgV-1序列，将其归类于临床常见的病毒，因为已知它们在免疫缺陷患者中高度流行。Anelloviridae (TTV、TTMV和TTMDV)是本研究中最普遍的病毒，这与异体造血干细胞移植受者高TTV病毒血症率一致。TTV、TTMV和TTMDV的高共检出率在之前已被描述过。慢性Anellovirus感染/再感染是常见的，但与GvHD疾病相关性仍未确定。在异体造血干细胞移植受者中，有两项研究未能证明TTV病毒血症与免疫相关并发症或其他病毒再激活之间有任何联系，而第三项研究报道了在接受GvHD糖皮质激素治疗的患者中TTV病毒血症较高。最近的一项研究发现， 移植后100天TTV病毒载量较高预示着更糟糕的总生存率，以及更高的急性GvHD和感染的风险。本研究显示，消化系统GvHD发生几周后，异基因造血干细胞移植受体粪便样本中Anelloviridae序列的检出率和数量增加，提示GvHD相关的炎症和/或免疫抑制治疗的后果。总之， 这些数据表明TTV病毒血症可能是一种潜在的免疫抑制标志物，但还需要进一步的研究。HPgV-1(黄病毒科)病毒血症发生在发达国家中1-4%的献血者和高达30%的异体源造血干细胞移植受者中，但未与临床后果相关。 考虑到HPgV-1与免疫系统的相互作用，持续性HPgV-1病毒血症的影响需要深入研究。

在14例患者中， mNGS分析发现了已知在移植受者中可重新激活的潜在DNA病毒(EBV, CMV, HSV-1, BKPyV，JCPyV, HBV)。在RNA水平上，还鉴定到HEV一次。利用r(RT-)PCR检测证实了mNGS的鉴定结果。其中，患者Ge05的rPCR检测证实为慢性HEV感染，患者Ge14的rPCR检测证实为慢性HBV和皮肤HSV-1感染，以及HSV-1病毒血症。 另外，BKPyV和JCPyV仅利用mNGS检测鉴定。在患者Ge06中，曾用常规方法进行BKPyV的检测，并在两份血浆样本中检测到了低病毒载量(1.41E2和1.44E3 copies/ml)，这两份样本是mNGS检测样本采集后隔几天采集的。 在12/25例患者中，在低病毒载量时仅rPCR检测到CMV和EBV。常规分子检测未检测到其他特殊的病毒。 该研究发现16%异体造血干细胞移植受者发生JCPyV病毒血症，这与同时使用多种免疫抑制治疗与持续性病毒血症风险增加相关的研究一致。在另一项研究中，移植后3个月和18个月，JCPyV DNA在患者血浆中的检出率分别从4/22下降到1/22，而病毒血症与任何临床表现无关。而该研究的BKPyV患病率(28%)低于另一项研究的54%。

3、临床不常见的病毒

利用mNGS在7例患者中发现了临床不常见的病毒，包括罕见和/或最近发现的病毒(HAstV MLB2, Usutu病毒，bufavirus ，cutavirus ，HPyV-6和HPyV-7)或没有随GvHD一起进行常规评估的病毒(典型的HAstV和风疹病毒)，7例患者的详细特征见表2。mNGS的检测结果同样用r(RT-)PCR进行验证，个别患者还有组织病理的验证结果。具体结果见表3。

表2. 7例非常见病毒感染患者的临床特征

表3. 7例非常见病毒感染患者的mNGS和rPCR结果分析

4、非常见病毒感染患者的简短临床描述

Ge02: HPyV-7

61岁男性，因淋巴瘤移植，出现消化系统和皮肤GvHD。移植物抗宿主病的免疫抑制持续时间为移植后12 - 16个月(4个月的样本期)，患者死于移植后的EBV相关淋巴瘤。从死亡前9个月开始，我们在所有筛查的血浆样本中发现HPyV-7。此外，在移植8个月后采集的BAL和骨髓样本中也发现HPyV-7。

Ge05: Usutu virus

一名23岁男性，因淋巴瘤接受移植，出现消化系统、皮肤和肺GvHD。移植物抗宿主病的免疫抑制持续时间为移植后1 - 24个月(样本期为22个月)，患者死于弥散性真菌感染和移植物抗宿主病。我们在分别于输血后7天和死亡前1.5个月采集的2份血浆样本中发现了乌苏图病毒。

乌苏图病毒(黄病毒科)是一种虫媒病毒，在非洲和几个欧洲国家流行，经常与西尼罗河病毒共同传播。病毒的地方性循环涉及鸟类(主要宿主)和嗜鸟蚊子(媒介)；人类是偶然的终端宿主。据报道，人类中有记录的急性乌苏里病毒感染病例不到50例。人类乌苏图病毒感染可无症状或伴有各种临床表现，包括发烧、皮疹和神经系统症状；在一些病例的脑脊液或血液样本中检测到病毒基因组。该病毒可感染神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和诱导多能干细胞(IPSc)来源的人神经干细胞，导致细胞增殖减少，诱导抗病毒反应，并凋亡。在本研究中，乌苏图病毒在输血后不久即被发现，但回顾性血袋检测是不可能的。虽然血液传播尚未被描述，但对13万多名献血者的筛查显示有38名阳性献血者。虽然该研究的病人没有明显的临床后果，黄病毒是已知的偶尔引起并发症，不能忽视。如果通过输血传播，有可能只传播了残余RNA，而不是传染性病毒。

Ge07: cutavirus

一名因急性淋巴细胞白血病而接受移植的60岁男性，出现消化系统GvHD。移植物抗宿主病的免疫抑制持续时间为移植后6 - 8个月(2个月的样本期)，患者死于弥散性真菌感染和移植物抗宿主病。在移植前3周进行的皮肤活检组织中发现了cutavirus，以及死亡前3个月的血浆中发现低载量的cutavirus 。尸检结果证实了消化道GvHD和播散型霉菌感染。

2016年，在巴西腹泻儿童的粪便中发现了Cutavirus ，患病率约为1-1.6%，奇怪的是，该病毒与皮肤T细胞淋巴瘤相关联。Cutavirus血症以前从未被描述过。

Ge09: bufavirus

一名65岁的男性，因急性髓细胞白血病移植而患上肝脏GvHD。移植物抗宿主的免疫抑制持续时间为移植后5 - 7个月(样本期2个月)，患者死于移植物抗宿主病。在死亡前2个月采集的几份血浆样本中检测到bufavirus的RNA。此外，移植后第一天、1.5个月的粪便标本和移植后5个月的十二指肠活检组织中也发现bufavirus，活检组织病理结果显示为慢性十二指肠炎。

Bufavirus 最早于2012年在儿童粪便样本中发现，粪便流行率约为0.3-4.1%，但在一些国家也有较高的血清流行率。Bufavirus 在有消化症状的受试者粪便中检测到，但在无症状对照中未检测到。Bufavirus 是否影响消化道GvHD综合征仍不清楚。Bufavirus血症以前从未被描述过。

Ge12: HAstV MLB2

一名44岁男性，因多发性骨髓瘤而移植，发展为消化系统和肝脏GvHD。移植物抗宿主的免疫抑制从移植后15天持续到移植后2个月(2个月的样本期)，患者死于移植物抗宿主病。在死亡前不久和死前14天收集的两份血浆样本中检测到HAstV MLB2 RNA，在死亡前几天进行的结肠活检组织，以及在几份肠道、结肠和骨髓尸检样本中均检测到HAstV MLB2 RNA。尸检结果证实存在肝脏和消化系统移植物抗宿主病，并发现慢性肺移植物抗宿主病。

Astroviruses 是公认的肠道病毒，主要感染儿童、老年人和免疫缺陷患者。HAstV MLB2在十年前被鉴定，已被证明在每个大洲传播。此外，它还与全身和中枢神经系统感染相关，并已在无症状儿童的粪便样本中发现。而HAstV血症似乎是由于GvHD和肠道穿孔导致的肠道位移。除了本例，还在一例消化道GvHD患者临死前血浆样本中发现了classic HAstV（Ge14）。

Ge14: rubella virus, classic HAstV, HPyV-6

31岁中国男性，因急性髓细胞白血病移植，发生消化系统和肝脏GvHD。移植物抗宿主的强烈免疫抑制在移植后9 - 11个月(3个月的样本期)，患者死于复发性消化道移植物抗宿主急性肠穿孔。在死亡前1个月开始的几个血浆样本中，发现了classic HAstV RNA和一个低病毒载量的野生型中国风疹病毒株。在死亡前2个月开始的血浆样本中也持续发现HPyV-6 DNA。移植前患者风疹血清检测阳性。

HPyV-6和HPyV- 7于2010年发现，并在健康受试者、移植受者和有症状的免疫能力患者的多种临床样本中被发现。但大多在非移植个体和移植受者的皮肤标本中检测到，与临床表现的相关性尚不确定。据报道， HPyV6和HPyV7在具有免疫能力和免疫缺陷的成人中的血清流行率分别为69 - 84%和35 - 72%。其传播途径、趋性、致病机制以及与其他疾病的潜在关联仍未知。健康献血者HPyV-6 DNA在肾移植受者阳性率为0.1%和0.6%，而在肺移植受者阳性率为0.6%，但携带者均无明显临床表现。本研究报道了2/25异体造血干细胞移植受者数月来血浆样本中持续存在HPyV-6/7病毒血症。需要进一步调查以确定其致病性。

Ge22: rubella virus

68岁葡萄牙男性，骨髓增生异常综合征移植，发生消化系统和皮肤GvHD。移植物抗宿主的免疫抑制持续时间为移植后4 - 6个月(6周样本期)，患者死于移植物抗宿主病。2份血浆样本检测到低病毒载量的风疹疫苗RNA。移植前患者风疹血清检测阳性。

风疹病毒感染是最意想不到的发现，病人的风疹序列比对到风疹病毒基因组的不同区域(Ge14和Ge22患者的风疹病毒基因组覆盖率分别为3.69%和5.47%)，并且Ge14和Ge22患者的mNGS结果分别被特异性rRT-PCR证实。虽然风疹病毒可以在体外和动物模型中持续存在，但在接种疫苗或自然感染后，一般不存在风疹病毒，接种疫苗的免疫缺陷儿童除外。慢性风疹感染也被认为是Fuch’s 异色虹膜睫内炎的病因，尽管其病理生理机制尚不清楚。 该研究在两名患者中发现了低载量的风疹病毒序列，每个患者都有不同的毒株:一种疫苗毒株和一种中国毒株，中国毒株是在一名曾在中国居住的患者中发现的。在中国本土人群中发现的普通疫苗株和中国毒株，表明疫苗重新激活与移植后的抗体丢失是一致的。与移植前的抗体滴度相比，两例患者中有一例在病毒血症时风疹IgG滴度降低。Gonzalez等人报道了一例儿童在接受干细胞移植后发展为暴发性肝炎的病例。 在人群中流通的疫苗株对于抗体减弱的免疫低下患者来说可能是个问题。那么移植后风疹病毒潜伏是否会引发移植物抗宿主病也有待研究。

结论

通过mNGS分析了25例GvHD异体造血干细胞移植患者血浆样本中的病毒序列，在96%的患者中发现了病毒，64%的患者有≥3种不同的病毒种类。除了共生体病毒(Anelloviridae和HPgV-1)和潜在已知在同种异体造血干细胞移植受者中高度流行/重新激活的病毒(EBV,CMV, HSV-1, BKPyV, JCPyV )，28%的患者样本中检测到临床不常见的病毒序列，这些病毒在异基因造血干细胞移植患者中很少/从未报道过，致病性未知(bufavirus, cutavirus, HPyV-6/7, novel HAstV-MLB2, classic HAstV, rubella virus,Usutu virus)。慢性HBV和HEV感染也在2例患者中被mNGS证实。

最近的一项试验将ruxolitinib确定为类固醇难治性移植物抗宿主病的二线治疗，GvHD疾病预后差，且没有批准明确有效的治疗方法。 在这项研究中，约有1/3的患者三级感染，强调监测患者感染的重要性。该研究发现，常规检测忽略了一些病毒感染，这可能提示ruxolitinib 30%的感染风险可能被低估，并提出了将mNGS分析纳入高危患者管理。

本研究的一个主要局限是小规模的单中心队列研究。此外，仅包括类固醇难治性/依赖性移植物抗宿主病的异体移植受者，没有将结果扩展到所有同种异体移植受者。此外，该研究缺少GvHD的对照患者。尽管mNGS发现了大量的病毒感染，但这些病毒感染是否针对GvHD患者或接受鲁索利替尼治疗的患者，以及是否与临床表现相关和/或对这些患者免疫状态的影响，仍有待于适当的研究来确定。

亮点

本研究利用mNGS对特殊队列即GvHD异体造血干细胞移植患者的血浆样本进行病毒序列分析，结果显示mNGS能够额外发现常规方法未检测出的病毒，某些病毒在异基因造血干细胞移植患者中很少/从未报道过。

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