文/华中农业大学陈昌福，武汉科研时代生物技术有限公司 周鑫军

正文/4756字

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陈昌福有话说

较长时间以来，不断地有人询问我们，从患病水产动物体内获得的分离菌株，在未完成其所属种类鉴定之前，就做分离菌株药物敏感性实验后，指导水产养殖业者选择和使用适宜药物治疗其疾病，这样的做法真的科学吗？

我们针对这个问题已经先后回复过一些读者了。对此问题的认知和依据是：

（1）水产养殖动物的疾病存在发生急、死亡快的特点，如果等待将分离菌株完成种属鉴定过程全部结束，弄清楚分离菌株所属种属后，再对分离菌株进行药物敏感性实验检测的话，可能患病水产养殖动物已经或者大部分就死掉了，即使完成药敏实验检测，对于水产养殖业者可能已经没有实际意义了；

（2）既然分离菌株是从患病水产养殖动物体内某些器官和组织种获得的，就说明分离菌株与水产养殖动物疾病的发生存在或多或少的关联，因为健康水产养殖动物的这些器官与组织中，通常都是处于无菌状态的。因此，我们针对这些分离菌株完成的药物敏感性实验结果，指导水产养殖业者药物治疗水产养殖动物的疾病，即采用药物帮助患病水产养殖动物抑制或者杀灭存在于这些器官和组织内的细菌后，对于药物治疗水产养殖动物疾病自然是有益的；

（3）我们按照这种操作方式指导水产养殖业者按照针对患病动物体内分离菌株的药敏实验结果，指导水产养殖业者依据药敏实验结果用药，均获得了良好的药物治疗效果。从而用实际治疗疾病的结果，证实了用这种做法是能指导水产养殖业者科学、精准使用水产用兽药的，是具有重要现实意义的。

摘要：本文内容介绍从患“溃疡病”黄颡鱼体内分离致病性菌株，针对分离菌株完成药物敏感性检测实验，并根据药敏实验检测结果选择抗微生物药物并确定治疗疾病的用药剂量后，在指导水产养殖业者精准用药、成功治愈患病黄颡鱼基础上，对分离菌株鉴定结果证明了从患“溃疡病”的黄颡鱼体内能分离到多种致病性细菌。本研究结果证明，当黄颡鱼体表受伤或者自身免疫系统的防御机能降低后，养殖水体中常在的多种微生物均有可能侵入黄颡鱼体内，而成为导致黄颡鱼发生“溃疡病”的条件致病菌。针对从患病黄颡鱼体内分离获得的分离菌株，在未完成对分离菌株种属鉴定时，首先完成分离菌株对抗微生物药物的敏感性检测实验，根据药物敏感性检测实验结果，筛选并确定抗微生物药物的用药剂量，对于有效地治疗黄颡鱼的细菌性疾病，是具有重要现实意义的。

关键词：黄颡鱼；溃疡病；抗微生物药物；药敏实验；精准用药

自2017年以来，在我国华中水产养殖地区的淡水越冬鱼类，每到初春时节均会发生摄食性鱼类，如草鱼（Ctenopharyngodon idella）、黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）、斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）和鲫（Carassius auratus）等暴发性死亡，即所谓的“越冬综合征”，对我国淡水水产养殖业已经造成了严重的经济损失。

本文内容主要介绍从外观症状主要为“溃疡病”、患“越冬综合征”黄颡鱼体内分离致病性菌株，针对分离菌株完成对各种抗微生物药物的药物敏感性检测实验，并根据药敏实验检测结果选择适宜的抗微生物药物、确定治疗疾病的用抗微生物药物剂量后，指导水产养殖业者成功地治愈患病黄颡鱼后，再进行对分离菌株的种属鉴定，并证明了从显示“溃疡”症状的患病黄颡鱼体内存在多种致病性细菌。

1.患“越冬综合征”黄颡鱼的主要症状

最近几年，淡水养殖鱼类的市场价格一直比较低迷。但是，因为黄颡鱼的市场价格却一直比较稳定。因此，黄颡鱼在华中水产养殖地区也有了越来越多的养殖。因为受到“越冬综合征”的影响，黄颡鱼的死亡也是比较严重的。每年从各个养殖地区送到“陈昌福鱼病防控实验室”的患病黄颡鱼也是比较多的，而且在送到实验室的患病黄颡鱼中，呈现鱼体表“溃疡”和“出血”症状的患病黄颡鱼数量也是比较多的（图1）。

图1 示患病黄颡鱼体表出现溃疡、出血的状况

2.导致养殖黄颡鱼发生“越冬综合征”的主要原因

关于我国华中地区淡水养殖鱼类“越冬综合征”的发病原因，几年前我们在许多养殖现场完成大量调查研究基础上，证明了是因为养殖业者在越冬前对养殖鱼类投喂了劣质饲料的缘故。因为劣质饲料难以满足越冬养殖越冬鱼类在漫长的越冬期间，对营养和能量消耗等生理需求，导致越冬养殖鱼类自身免疫系统的防御功能大幅度降低，已经丧失机体免疫防御机能的越冬养殖鱼类，就容易遭受养殖水体中常在的致病性细菌入侵。这些进入到养殖黄颡鱼体内的致病性细菌，也就成为了养殖黄颡鱼发生“越冬综合征”的“帮凶”。

3.从呈现“溃疡病”症状的黄颡鱼体内分离致病性菌株

采用微生物学方法，从各地送来实验室并委托我们诊治患病黄颡鱼的鱼体中，挑选体表出现明显“溃疡”症状的个体。在无菌条件下，解剖患病黄颡鱼并从其肾脏、肝脏和脑中挑取致病菌，接种在盛装有脑心浸液琼脂培养基（BHIA，Difco）平皿中，将接种致病菌的培养皿置于28.0℃恒温培养箱中，培养48.0h后，再从长出菌落的培养皿中挑取单个菌落，接种在盛装有BHIA培养基的培养皿中，完成分离菌株的纯化培养过程。

4.患病黄颡鱼体内分离菌株的种属鉴定

从2023年4月至2024年4月，将从各地送来实验室委托诊治疾病的黄颡鱼体内共分离纯化40多个分离菌株，从中随机选取20个分离菌株，送到中国水产科研究院长江水产研究所，委托相关研究人员协助鉴定分离菌株的所属的种属。

利用16s rDNA分析技术，对分离菌株进行基因组DNA提取后，进行PCR扩增并进行序列分析后的，对分离菌株完成的鉴定结果如表1所示。由表1所示结果可以看出，在不同养殖区域送来实验室，显现“溃疡”症状的患病黄颡鱼体内获得的分离菌株，被鉴定为海豚链球菌（Streptococcus iniae）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）、嗜水气单胞菌（A.hydrophila）、类志贺邻单胞菌（Plesiomonas shigellodes）、贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）、大肠杆菌（Escherichia coli）和霍乱弧菌（Vibrio cholerae）等多个种类。

表1呈现“溃疡病”症状黄颡鱼分离菌株的鉴定结果

5.抗微生物兽药对患病黄颡鱼分离菌株的最小抑菌浓度（MIC）

表1本试验中供试抗微生物兽药种类、生产批号和最小抑菌浓度（MIC）

依日本化学疗法学会制定的标准法进行。即首先将供试抗微生物兽药（表1）用适宜的溶媒预溶后，用灭菌生理盐水按照上述制剂中抗微生物药物的含量，分别稀释至1000~0.20mg/L的２倍稀释的浓度。

然后用脑心浸液培养基（BHI，Difco）将各浓度的药物液稀释10倍，从而使培养基中的各种药物的浓度达到100.0~0.025mg/L的２倍稀释的浓度。

最后向每支盛有2.9mL培养基的试管中加入0.1 mL浓度为1.0×106cfu/mL活菌液，在28℃条件下连续培养3d，经肉眼观察证实无细菌生长试管中的最低药物浓度，即为某种抗微生物药物对分离菌株的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）。

6.根据MIC和“用药系数”计算用药量精准用药治疗疾病效果良好

从不同地方送来患病黄颡鱼体内获得分离菌株，在完成分离菌株对各种抗微生物兽药的药敏实验中获得的MIC，参照日本学者对不同种类养殖鱼类的用药系数（6.3），计算出适宜抗微生物兽药的用药量，添加在黄颡鱼饲料中制备药物饲料。每天投喂1次药物饲料，连续投喂5~7d为一个用药疗程。

根据送检患病黄颡鱼的养殖业者回馈给我们的信息，对各地的患病黄颡鱼均获得了良好药物治疗结果。

7.结论与讨论

7.1养殖鱼类“越冬综合征”的发病原因

根据我们对各地多个水产养殖场完成的调查研究结果，养殖鱼类“越冬综合征”是因为在越冬前摄食了较长时间劣质饲料的缘故。因为劣质饲料中营养物质成分不能满足养殖鱼类在越冬期间的需求，导致免疫系统的防御功能低下，对养殖水体中常在的致病性细菌丧失抵抗力。大量致病性细菌入侵到已经丧失免疫功能的越冬鱼类体内，成为越冬鱼类发生“越冬综合征”的“帮凶”。

7.2养殖鱼类相同疾病症状可能由多种致病性生物引起

本研究中，从来自不同水产养殖场，其体表显现出“溃疡”相同症状的黄颡鱼体内，分离鉴定到海豚链球菌、粪肠球菌、维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌、类志贺邻单胞菌、贝莱斯芽孢杆菌、大肠杆菌和霍乱弧菌等多种致病性细菌。这个结果不仅证明了患病黄颡鱼体表“溃疡”症状，可能是由多种不同的致病性细菌引起；同时，也说明了当养殖黄颡鱼自身免疫系统丧失免疫防御功能后，养殖水体中常在的大量“条件致病菌”，均有可能侵入到养殖鱼类体内，而成为某种养殖鱼类发生“越冬综合征”的“帮凶”。

7.3用未经鉴定种属的分离菌株完成药敏实验指导科学、精准用药具有现实意义

本实验研究中，针对从患病黄颡鱼体内分离菌株，在未经鉴定其所属种属之前，就完成对分离菌株对各种抗微生物兽药的药敏实验，依据获得MIC计算治疗疾病的用药量，指导水产养殖业者精准用药后，均获得了对患病黄颡鱼良好的药物治疗结果。

这种实验结果说明，为了及时地做到科学、精准地使用药物治疗患病水产养殖动物疾病，在针对未经其所属种属鉴定的分离菌株，可以避免因为等待对分离菌株完成种属鉴定的结果，而延误药物治疗水产养殖动物疾病的最佳时机。因此，采用从患病水产养殖动物体内分离获得的未经鉴定种属的分离菌株，完成药敏实验的结果指导水产养殖业者科学、精准地选用水产用兽药，是具有重要现实意义的。

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作者：华中农业大学陈昌福；武汉科研时代生物技术有限公司周鑫军。

编辑：朱洁珊

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