1、细胞冻存与复苏原则：慢冻快融在超低温的液氮中进行冻存（-196度）。在冻存过程中，随着温度 的改变，细胞内部结构讲发生一系列的变化。细胞快速冻存时，将会 受到很大的损伤，甚至导致细胞的死亡。温度急速下降时细胞脱水少， 还会使细胞内结冰。细胞内冰晶的形成会造成蛋白质和酶的变性，以及细胞器的损伤，并最终导致细胞的死亡。因此，冰冻细胞时，应使 温度缓慢下降，从而使细胞内水分渐渐脱出，使细胞内不结冰。由于 冰冻细胞体中的冰晶体很小，融化时必须快，以防这些微小晶体转化 为较大的冰晶体。因此，细胞的冻存和融化过程要在 缓冰速融”下进 行。一般冷冻时，在-30度之前药缓慢降温，速度控制在 每分钟下 降1度，

2、30度以下可快速冷冻，使温度降至196度。冰冻时还要加入510%的甘油或二甲基亚碉 作为冷冻保护剂。 因为二者分子量小，容易穿透细胞降低细胞内的冰点， 并提高细胞膜 对水的通透性，加上缓慢冻存，可使细胞内的水分渗出在细胞外形成 冰晶，从而避免细胞损伤。在细胞复苏过程中，必须快速溶解，否则容易造成细胞外溶解的水 分进入细胞内重新形成冰晶，造成细胞死亡。、细胞复苏如果冻存前细胞状态好，而且冻存时间长，复苏用的培养液没问 题的话，复苏细胞出现问题最可能的原因是解冻时间过长和解冻后没 有及时稀释接种KEY：1冷冻细胞之活化原则为快速解冻 ，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。2细胞活化

3、后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常（例如产生单株抗体或是其它蛋白质）。Protocal（以贴壁细胞系tsA201 为例 ）1.准备材料：37c40c水浴，37 c预热培养液，离心管、 血球计数盘与盖玻片2细胞实验室进行常规消毒，紫外照射30 min 以上， 超净台开启通风 10 min 。 培养液孵温至于373培养液回温后喷以70 % 酒精并擦拭，移入无菌操作台内。将 7-10 ml 左右新鲜培养基移入离心管中，备用。4. 带上厚手套用镊子将冻存管从液氮保存罐中取出（操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害），检查盖子是否旋紧（由于热胀冷缩过程，此时盖子

4、易松掉）。立即放入40水浴中，轻摇冷冻管使其在快速全部融化（如果冻存管封闭不严格,在水中出现气泡,那么细胞无法继续使用） ，以 70 % 酒精擦拭冻存管外部，移入无菌操作台内。5. 将细胞悬液移入已加培养基的离心管中，稍微吹打混匀，低速离心（ 1000rpm ， 4min ）去除上清，加入适量培养液重悬，计数，调整细胞浓度，37 5%CO2 培养。 取 0.1ml 解冻细胞悬浮液作存活测试。6. 24h 后观察细胞，视情况是否换液，继续培养7. 记录复苏日期。注意事项：安全防护1 液氮取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。2冻存管爆裂细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导

5、致爆炸。为防止冻存管在升温时爆裂等，可以在放入水浴前就实现在超净台里把盖子拧松一下然后再拧上。从液氮罐里拿出来不是说一定要分秒必争地放入水浴。细胞从液氮的零下1 百多度升到比如负八十这个过程对细胞没有损害。有足够的时间 handle 这些。只不过一旦细胞化了，就应该争分夺秒地把它放入培养液了，主要是为了稀释DMSO。 常温下高浓度DMSO 对细胞的损害比较大。温度与速度 3740C。如果复苏温度太低，会造成细胞的损伤，水浴温度 40C 应该也没问题，但不能太高了。 常温下二甲基亚碉（DMSO）对细胞的毒副作用较大，因此，必须在 1-2 min 内使冻存液完全融化。离心与换液与培养 解冻后是否立

6、即去除冷冻保护剂（例如DMSO或glycerol）,依细胞种类而异。目前主要有两种见解。一种为标准流程。将解冻后的细胞悬液先进行离心，以去除冷冻保护液 DMSO 对细胞的损伤，所以须将离心后的液体前倒净，且一定倒干净。但是离心也会对刚复苏的状态欠佳的细胞产生损伤。因为离心的目的是两个，去除DMSO,去除死细胞，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。此外在操作过程中容易污染。另一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。但此种方法这可能使培养基中少量的DMSO对细胞造成损伤。 离心前须加入适量培

7、养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，加入适量量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。 如果不离心，加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO 的浓度，从如果你加培养基的太少，那么 DMSO 的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资料来看， DMSO 的浓度在小于0.5% 的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1 %。所以如果你的冻存液的浓度是10 % DMSO的话那么加 10ml 以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度 细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml 细胞液要加10ml 15m 培养液，但培养基加多会增加悬浮力，细胞不好贴壁，所以有时培养基

8、越少细胞越容易贴附。Troubleshoot （以 Raji 为例）1. 取错细胞：拿错冻存管。（快快快，匆忙之中，难免出错，况且170 多度，冻手！）=> 核查记录册及冻存管上细胞的名称、时间是否一致。=> 拿细胞时戴手套！2. 水浴时间太长：2min 还没融化。（冻存管的壁较厚，隔热）=> 适当提高水浴温度（37 度40 度）=> 要是冬天，就选用保温盒。3. 冰盒内时间太长：复苏1h 后，还没有加入新的培养液。（高浓度DMSO防止胞内形成冰晶，冻存时保护细胞，但复苏融解后，浸泡时间太久会，对细胞有毒性）=> 提前预定超净台，减少复苏后插在冰盒里等待的时间。4

9、. 失去耐心：复苏三四天后，细胞没有任何动静，认为失败，倒掉所有细胞。（有些细胞复苏后一星期，才有起色）=> 不要换液，耐心等待，两周后再做决定。经验与讨论： 不必等细胞全化了再从水浴里取出来。只要冰块浮起来了就差不多了。我一般最多水浴不超过 1.5 分钟。然后经过喷酒精消毒什么的差不多又半分钟过去了。每次都还有没化的。先把已经融解的部分吸到培养瓶里，再从培养瓶里吸些培养液到冻存管里，余下的冰块瞬间就化了，再一起吸到培养瓶里。 恒温水槽的温度最好在40 度左右 （个人经验），冻存管内液体融化较快，温度又不至于太高损伤细胞。 解冻一分钟之内完成最好，38 度水浴锅里快速搅动，50 几秒就好

10、了。 DMSO4度以下对细胞毒性小，但4度以上对细胞毒性则显著增强，所以还是建议复苏后离心 袪除冻存液， 离 心转速可以控制1000 左右 。复苏在于快，我一般是将其放入50 度左右水浴中（37 度水浴中冻存管内肯定不到37 度） ，摇动不到1 分钟，一成液状时就拿出水浴，（此时冻存管内温度还较低，避免DMSO对细胞毒性）， 这样复苏细胞活力与冻存前近似。 刚从实验室同事那里学到的好方法，据说屡试不爽：1 将冻存细胞的冻存管取出，迅速放于100 Ethanol 中，置于室温溶化，约1min （据说比加温好）；2 取 1ml 冻存的细胞加入10ml 培养基轻柔混匀；3 . 37 度 5二氧化碳孵

11、箱培养；4 3-4 小时左右，视细胞情况换液（大部分细胞贴壁以后）。不同的细胞可能会有一些不同，需要自己根据实际情况摸索。 可以提前把需要的体积的培养液放到培养瓶里，拧松瓶盖，放到孵箱里半小时到1 小时， 这样温度和ph 值都已经最适合细胞生长了。 复苏后 1-2 小时，待细胞贴壁后，缓慢将培养液倒出，加入新鲜培养基，血清（15% ），培养3 天观察 有时候 , 在液氮中冻存了很多种细胞, 复苏的时候可能会将许多细胞取出来,捡出需要的细胞时,最好用泡沫盒盛上一些液氮,将细胞放在泡沫盒的液氮里,慢慢找你想要的（对于细胞这玩艺,还是能快就快哈 ）, 这样对细胞的影响最小,你也不会手忙脚乱了。 不一

12、定非要60S 不可， 只要在 37 度水浴中不断摇动直到大部分冻存液溶解即可拿到培养室内，此后，可低速离心约5 分钟换液或者是将细胞直接稀释到已含有培养基的培养瓶中，待其贴壁过夜后再更换培养液，我两种方法都用过，效果都还行。但对于第二种方法要视细胞的具体情况而定，我用的是231 细胞和 MCF7 细胞，没有问题 至于离不离心, 可以作一个对照,复苏的时候一瓶离心,一瓶不离心,对照一下哪种对细胞的生长状态好一点.这个是没有公认的,只有自己体会 .复苏的时候尽量离心一下，把 DMSO除去，然后可以等细胞贴壁状态好的时候再换液，没必要死板套天数换液。像U937、 Jurkat这种悬浮细胞，养的时候都

13、比较好养，但复苏时就相对比较困难。我做的经验是：离心去掉大部分冻存液上清加入新鲜1640 培养基，放置一段时间2-3 天甚至再长一段时间，期间不用更换培养基但要每天观察，直到细胞状态好细胞数增多，如Jurkat 细胞出现抱团现象，这时再按常规方法培养就行了。悬浮细胞刚复苏细胞碎片是比较多，但一旦细胞状态好生长速度也比较快，多传几次就好了。 复苏细胞在去除冻存液时，离心速度要小，小于500 转，速度太大，对细胞也有损伤 溶解后应迅速吸出加入已准备好的含有5 倍体积以上的培养液或pbs的离心管中，吹打均匀，充分稀释冻存液中 dmso,离心后接种。因为常温下 1%DMSO 对培养细胞的毒性就很大，一

14、般冻存液中 dmso 浓度为 10%， 所以理论上需要10 倍稀释后再接种，但实际操作时5 倍稀释问题不大。而且5ml 的离心管比较常用。 适当高一点的温度，可以加速溶解，减少冰晶破坏细胞的可能性。通常两分钟内融解即可。另外无论是冻在-80 还是液氮 , 取出来后迅速放到3740 度温水里水浴,摇晃冻存管,让其融化,时间不一定要求在一分钟之内,但尽量快.待留仅有少余冰晶（留冰晶目的是减少DMSO对细胞损伤）即可拿出，加入10倍体积无血清培养液低速离心（一般是1000rpm,5min）, 去上清 ,加入培养液使细胞重悬,然后移入培养瓶中,在根据情况添加适量培养液. 个人觉得如果复苏时离过心，在换

15、液的时候就不要洗涤细胞了。 我们实验室解冻时都是用40 度，而且复苏后的细胞成活率很高，基本没有死细胞，状态也很好，然后把血清浓度调高些，培养基不要加多会增加悬浮力，细胞不好贴壁，可以再试着复苏一次二、细胞冷冻保存KEY: 一、细胞的生长状态二、冻存液的配制 三、是冻存步骤，采取程序降温Protocal（ 以贴壁细胞系为例）1 冷冻前 24-48 小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。2准备材料：生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO（Sigma D-2650） 、胰酶 37回温、无菌塑料冷冻保存管、离心管、 0.4（ w/v） trypan blue（GibcoBRL15250-

16、061） 、血球计数盘与盖玻片、冻存装置（等速降温机或简易冻存盒或脱脂棉、医用纱布或泡沫盒）2细胞实验室进行常规消毒，紫外照射30 min 以上， 超净台开启通风 10 min 。胰酶37培养液孵温3配制冻存液：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚碉（DMSO）至10%浓度，混匀，4c待用。4.细胞处理：PBS清洗细胞，胰蛋白酶消化，血清终止。低速离心 （1000rpm, 5m） 收集细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液计数细胞浓度及冻前存活率。5冻存：标记冷冻管（注明细胞名称、代数、日期）。细胞离心，弃上清，将细胞沉淀用1ml冻存液悬浮，使细胞浓度为1 5x106c

17、ells/ml，轻柔吹打混合均匀，转移至已标示完全之冻存管（12ml/vial ）。并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，然后进行冻存。脱脂棉包裹，可直接放于-80 冰箱，改日（一般应在三个月内）移于液氮罐中。（ 一般在复苏细胞后传代时即冻存一批细胞，细胞复苏时可种3 个培养皿 ，传代时一皿细胞用于实验，用胰酶消化并计数；另两皿直接吹打下来参考前一皿的计数，直接用冻存液悬浮，根据前一皿的细胞计数调整细胞浓度并冻存。）注意事项：若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture ，以防止冷冻失败。细胞1冻存细胞健康程度 细胞应在生长良好（logphase）且

18、存活率高之状态，约为8090致密度。一般要求活细胞在95% 以上（冻存细胞之前，用台盼兰测细胞活性 ， 最好是100活性）， 细胞活力差的在冻存后的成活机率很小，因此，一定要在细胞旺盛分裂时期冻存细胞也不能长得太满，密度在8090%左右，否则就老化了，复苏后状态不好,很难存 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。 冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基（建48小日寺前更 换，因悬更换新培餐基封余田胞也是一槿屋力），使细胞处于指数生长 期以维持好的细胞状态2冷存细胞浓度： normal human fibroblast:13M0

19、6cells/mlhybridoma:13M06cells/ml,细胞浓度不要太高，某些 hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24 小时后死去。adherent tumor lines:（5- 7M06,依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度，而 HeLa只需13X106cells/mlother suspensions: 10M06cells/ml, human lymphocyte 须至少 5X106cells/ml。 冻存时提高细胞的密度，减少冻存体积同样有利于复苏时的快速解冻。尽量不要多于1ml， 0.5 0.8 足够。常用冷冻保存液：1 细胞冻存液一般

20、有两种配置方法： 培养基：血清：DMSO=7： 2： 1 或者6： 3： 1 或者5： 4： 1 血清： DMSO=9： 1无论选择何种，大原则是 DMSO不超过10%, 10%指终浓度！因为有细胞毒性，一般都采用10% ，普通细胞系可以用第一种配方冻存，比较娇贵的细胞系用第二种配方冻存，如果实验室条件允许的话，可以都用第二种方法2. DMSO （二甲基亚碉）细胞冻存中，一般使用DMSO 作为保护剂。避免冻存产生的冰晶对细胞的损伤。DMSO是一种含硫有机化合物，分子式为（CH3） 2SO,常温下为无色无臭的透明液体，具有吸湿性的可燃液体，既有高极性，高沸点， 非质子， 于水混溶的特性，毒性极低

21、，热稳定性好，能溶于乙醇，丙醇，苯和氯仿等大多数有机物 质量控制1 DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色（以 0.22micron FGLPTelflon过滤或是直接购买无菌产品， 如Sigma D-2650）,以5 10ml小体积分装，4避光保存，勿作多次解冻。2 DMSO 一般要用新鲜的，分装保存 ，如果多次开评后，可能受氧化而变质，如果DMSO颜色为黄色，表示已经变质，不可用3 .在细胞冻存中所用的DMSO一般纯度高，无菌，可以直接使用，不需要灭菌的。当然DMSO 也可以用高压灭菌后的甘油代替。DMSO无需除菌。建议不用高压过滤除菌，一则其本身具有一定的抗菌效果，二则高压有冒爆炸的危险：

22、（，一般的过滤器也不能用来过滤DMSO，膜会被破坏的。只要 DMSO是细胞培养专用，操作时尽 量小心，不用担心污染。 终浓度在细胞冻存中，DMSO 使用的最终浓度一般是5-15% ，某种具体细胞的冻存液中的DMSO浓度可以从ATCC查至限对特别敏感的 细胞特别是杂交瘤细胞在冻存时使用95% 血清和 5%DMSO 可能会好些。总之要根据细胞具体情况来定。DMSO的浓度会影响冻存效果，一般是用10%；有文献报道了，比较 DMSO的浓度，结果是低于10%时，随着DMSO的浓度增大，细胞存 活率增加;但 10%以上不能再明显提高细胞存活率,10% 与 15%无明显差异 使用注意事项1） DMSO本身对

23、细胞有毒性，MTT法中就是用它来溶解细胞的。 室温的DMSO对细胞损伤大，在4-8度时对细胞的毒性较低。另外， DMSO加入培养液后会产生大量的热，若直接加到细胞悬液中会使大 量的细胞死亡。所以在使用时先可用培养液或血清配成最终浓度的2倍， 4 度预冷 ，再与等体积的悬浮细胞的培养液混合。一定要保证冻 存液与细胞接触后最少4 度的低温。2） DMSO的主要作用是防止冰晶的形成，因此如果在 4度放置过久，冻存的效果不会好！加入冻存液后一定要混匀 ，防止 DMSO沉淀。3）混合DMSO要快，因为DMSO对细胞有毒性，混合之后应 尽快冻存4）配制冻存液时，要试管先安比例配好，混匀，再和细胞混匀，不要

24、分别把培养基和 DMSO直接加入到细胞中，尽量减少 DMSO对细胞的毒性。当然，有时直接加10% 冻存液也能成功，但有风险先制备双倍冻存液，可避免DMSO 直接加入时释放的热量对细胞的损伤。在加 20% 冻存液 （加入量与细胞悬液的量等比，使 DMSO的最终浓度为10% ） 时尽量缓慢逐滴加入，以尽量降低细胞内外DMSO浓度差过大使细胞逐步适应高渗，降低细胞受损。5）也可用冻存液直接悬浮细胞。3. Glycerol （甘油）可用甘油来代替DMSO。例如DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10% 甘油冻存。 甘油应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。 在开启后一年内使用，因长期储存

25、后对细胞会有毒性。4血清 冻存可用10%90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力 20% 终浓度有利于细胞悬浮而少沉积（4 度时），复苏存活率在80%90%以上 原代培养细胞，以90% 血清冻存更为有效冻存方法1 传统方法：冷存管置于4 c 10分钟一-20 C 30分钟一-80 C 1618小时（ 或隔夜）- 液氮槽 vaporphase 长期储存。20 不可超过1 小时， 以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80冰箱中，惟存活率稍微降低一些。2 程序降温： 程序降温仪，优先推荐使用这个利用已设定程序的等速降温机以-1-3 C/分钟之速度由室温降至（ -80以

26、下）-120 ， 再放在液氮槽vaporphase 长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保存。 简易的细胞冻存盒，夹层之间有异丙醇,用之前需要室温平衡,放入 -80 度后 ,能保持温度按照1 度 /min 的速度下降 简易方法 用吃冰激凌的那种泡沫盒，超市的特惠装那种，15 块钱左右，无需棉纱，直接将冻存管置于其中，盖好盖子，直接丢80，隔夜再转至液氮内。 可以在冻存管外面包上棉花，直接放在-80 摄氏度冰箱就能够达到缓慢降温的效果了，如果要长时期冻存的话再转移至液氮罐中就好了冻存时间细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力；在 -70度可保存数月。 应尽快从 -80

27、度冰箱转移到液氮。冰箱门总是开门，而且冻存细胞时放在-80 度冰箱最好不要超过一个月冻存管 corning 的冻存管或无菌塑料冷冻保存管（Nalgene5000-0020） 冻存管在冻存前一定要拧紧 ，否则在复苏的时候会爆炸；复苏水浴时会渗水，造成污染。Troubleshoot （以 Raji 为例）1. 错误的时机：细胞状态不好（长的太过了，培养液已经很黄；细胞可疑污染；细胞已经开始凋亡或崩解；连续培养超过二个月，细胞性状已有改变改变）最佳时机：细胞增殖旺盛，情况稳定，试验效果良好，复苏后两周内2. 细胞太少：冻存时细胞浓度低于 1-5 M000,000/ml。（复苏很难成功）离心后调整细胞浓度