透化治疗什么iMeta ｜ 中国药科大学顾丰组-解析黄葵治疗糖尿病肾病机制
单细胞和空间转录组学揭示了黄葵治疗糖尿病肾病的潜在分子机制
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研究论文
● 原文: iMeta (IF 33.2, 中科院双一区Top)
● 英文题目: Single-cell and spatial transcriptomics reveals potential molecular mechanisms of Abelmoschus manihot (L.) Medic in treating diabetic kidney disease
● 中文题目: 单细胞和空间转录组学揭示了黄葵治疗糖尿病肾病的潜在分子机制
● DOI: https://doi.org/10.1002/imt2.70099
● 2025年12月8日中国药科大学顾丰、吴洁和泰州大学唐海涛等iMeta在线发表了题为“Single-cell and spatial transcriptomics reveals potential molecular mechanisms of Abelmoschus manihot (L.) Medic in treating diabetic kidney disease”的文章。
● 本研究使用单细胞转录组联合空间转录组技术解析肾脏转录组图谱，系统性筛选并确定了黄葵总黄酮、厄贝沙坦在糖尿病肾病治疗中的异同，在转录调控的分子水平上解析了两种药物治疗糖尿病肾病的分子机制，为糖尿病肾病的治疗提供了新的见解。
● 第一作者：吴晨华
● 通讯作者：顾丰（feng.gu@cpu.edu.cn）、吴洁（wujie@cpu.edu.cn）、唐海涛（tanghaitao@tzu.edu.cn）
● 合作作者：余怡虹、宋钰晖、葛海涛、沈一鸣
● 主要单位：中国药科大学、烟台毓璜顶医院、泰州大学、南京中医药大学、齐鲁医药学院
● 本研究结合分辨率为0.25微米的空间转录组测序（stereo-seq）与单细胞全长RNA测序技术（scFAST），从转录组调控的角度构建了厄贝沙坦与黄葵总黄酮治疗糖尿病肾病的调控网络；
● 通过全转录组基因筛选和分子对接模拟，本研究鉴定了TFA治疗DKD的关键肾脏受体（如Itga3、Itga5、Tgfbr1等）和调控因子（如Jun、Junb、Stat1等）；
● 本研究为A. manihot以及其它中药成分治疗DKD的药理机制筛选提供了新的见解。
近期的一项临床研究表明，植物黄蜀葵花（Abelmoschus manihot (L.) Medic.）提取总黄酮（TFA）制成的黄葵胶囊（HKC），与厄贝沙坦（IRB）联合使用时，是治疗糖尿病肾病（DKD）的有效方案。为阐明黄蜀葵治疗 DKD的药理机制，本研究采用空间转录组测序（stereo-seq）与单细胞全长RNA测序技术（scFAST），系统解析黄葵总黄酮（TFA）及IRB干预后db/db小鼠肾脏的病理生理复杂性。通过线粒体功能评估、免疫细胞浸润分析、空间共现计算、细胞通讯网络解析、转录因子表达网络预测及免疫荧光验证，构建了DKD 病理进程与药物应答的空间转录调控图谱。研究数据显示，相较于IRB，TFA通过调控“代谢紊乱-线粒体功能障碍-缺氧-免疫细胞浸润-肾损伤”调控轴，在减轻DKD小鼠肾脏免疫细胞浸润、纤维化及缺氧状态方面表现出更强的调控活性。在TFA的活性成分中，槲皮素除广泛抑Tgfbr1通路外，还可特异性抑制Itgb5-信号转导Stat1通路，进而抑制肾脏纤维化进程中的巨噬细胞浸润。本研究为深入理解黄蜀葵治疗DKD的药理机制提供了全新视角。
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引 言
糖尿病是全球重大公共卫生问题，其中2型糖尿病（T2D）是主要发病类型，占比超过90%。糖尿病可引发糖尿病肾病（DKD）这一严重并发症，约40% 的T2D患者会患有DKD。其仍是终末期肾病和心血管疾病死亡的主要原因之一，给医疗资源、社会及家庭经济带来沉重负担。目前，DKD的临床治疗需采取综合策略，包括调整生活方式、控制血压、减少血糖、血脂与蛋白尿等关键指标。中医药在DKD治疗中具有独特优势，尤其在整体调控、控制不良反应、改善症状及延缓疾病进展方面表现突出。
黄葵胶囊（HKC）是基于黄蜀葵乙醇提取物制备的中成药，1999年经国家药品监督管理局批准用于临床，适用于包括 DKD在内的肾脏疾病治疗。黄蜀葵的研发历程与青蒿素相似，均源自葛洪的古代医籍记载，经现代提取技术精制，并通过随机对照试验验证，最终形成标准化药物制剂。2015年版《中华人民共和国药典》记载黄蜀葵花具有“清热利湿、解毒消肿”的功效。包括本课题组在内的现代药理学研究表明，黄蜀葵的核心活性成分主要是七种黄酮类化合物的混合物，包括芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、杨梅素、槲皮素及槲皮素-3-O-洋槐双糖苷。三年前，一项多中心随机双盲平行对照临床试验显示，HKC联合厄贝沙坦（IRB）可有效降低中国T2D中DK患者的蛋白尿水平。但与单一化合物的青蒿素不同，黄蜀葵花的活性成分是多组分黄酮复合物，因此阐明其治疗DKD的分子药理机制仍是一项挑战。
近年来，本课题组围绕黄蜀葵治疗DKD开展了系列基础研究。此前采用广泛用于T2D及DKD研究的db/db小鼠模型，通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术解析了HKC在模型小鼠肾组织细胞中的配体-受体-转录因子调控网络。研究发现，HKC可通过Fgfr1、Itga1、Lrp5等受体介导，经Klf2、Cebpb、Rel等调控因子，调节与免疫、纤维化及肾脏结构相关的下游靶基因。这些研究结果为揭示黄蜀葵花治疗DK的分子机制奠定了基础。
结 果
病理检测结果显示TFA在治疗糖尿病肾病方面拥有与HKC相当的实验依据
与scRNA-seq相比，空间转录组学（ST）能够对完整组织切片中的基因表达谱进行高通量重现。这项前沿技术已广泛应用于大脑、蜕膜、胚胎等结构复杂的三维器官病理生理学研究。肾脏作为结构精密的器官，由肾单位这一功能单位构成，其髓质与皮质在结构、功能及位置上均存在显著差异。近期人源DKD的ST分析相关数据报道，为我们应用该类技术探究DKD治疗相关的分子药理机制奠定了基础。本研究首次采用0.25μm分辨率stereo-seq与scFAST-seq技术，构建了db/db小鼠肾脏细胞的单细胞分辨率病理状态及总黄酮（TFA）干预后的空间转录组图谱。本研究旨在深入阐明黄蜀葵治疗DKD的分子药理机制。
苏木精 - 伊红（H&E）染色结果显示，与对照组（db/m 小鼠）相比，DKD 组小鼠肾脏出现多种病理改变，包括肾小球硬化、系膜基质增生、胶原沉积、结节性肾小球硬化（Kimmelstiel-Wilson 结节）、肾小球基底膜均质化增厚及大量炎症细胞浸润（图 1A）。TFA 与 IRB 干预可减轻 db/db 小鼠肾脏上述病理特征的进展，证实其对 DKD 具有治疗作用。
图1.肾脏组织病理学与空间转录组学的DKD与药物治疗细胞图谱
（A）H&E染色显示DKD的关键病理特征，包括胶原沉积（左上，DKD组）、系膜基质增生、结节性肾小球硬化（Kimmelstiel-Wilson 结节，左下，DKD组）、基底膜增厚（右上，DKD组）及炎症细胞浸润（右下，DKD组）。比例尺=100 μm。（B）空间转录组分析在肾小管、肾小球及肾间质中鉴定出16种不同细胞类型（包括PTC、DLH、ALH、DCT、CD-PC、CD-IC、EnC、PEC、Podo、SMC、MC、T 细胞、Mac、B 细胞、Neu及NKC），并通过其真实物理学解剖坐标进行可视化呈现。x轴和y轴仅表示芯片方位。（C-E）利用经典标志物基因验证细胞类型身份：肾小管区域包含PTC、DLH、ALH、DCT、CD-PC 及 CD-IC（C）；免疫细胞群（包括 T 细胞、Mac、B 细胞、Neu 及 NKC）主要定位于肾间质（D）；肾小球区域由 EnC、PEC、Podo、SMC 及 MC 组成（E）。
TFA与IRB可有效降低DKD小鼠的免疫细胞浸润水平
经过稳定的基于细胞类型分解（RCTD）的预测及标签转换后，我们从1,468,901个细胞bin中筛选得到1,254,363个单细胞，这些细胞来源于三类肾脏结构：肾小管（RT，1,207,222个）、肾小球（37,187个）及免疫细胞（ICs，9,954个）（图 1B）。通过经典细胞标志物进一步验证了这些细胞的生物学身份（图 1C-E）。肾小管细胞包括近端小管细胞（PTC，标志物Kap、Pck1，1,020,959个）、亨勒氏袢降支细胞（DLH，标志物 Cryab、Aqp1，7,394个）、亨勒氏袢升支细胞（ALH，标志物Slc12a1、Umod，101,460个）、远端小管细胞（DCT，标志物 Slc12a3、Pvalb，38,735个）、集合管主细胞（CD-PC，标志物Aqp2、Fxyd4，19,925个）及集合管夹层细胞（CD-IC，标志物 Atp6v1g3、S100a1，18,749个）。肾小球细胞包括内皮细胞（EnC，标志物Flt1、Ptprb，13,359个）、壁层上皮细胞（PEC，标志物H2-K1、C3，4,971个）、足细胞（Podo，标志物Nphs2、Podxl，12,676个）、平滑肌细胞（SMC，标志物Acta2、Myl9，6,172个）及系膜细胞（MC，标志物Ccar1、Nr3c1，9个）。免疫细胞包括T细胞（标志物Cd3g、Cd3e，129个）、巨噬细胞（Mac，标志物Lyz2、C1qb，6,804个）、B 细胞（标志物Slpi、Iglv1，1,409个）、中性粒细胞（Neu，标志物S100a8、S100a9，1,569个）及自然杀伤细胞（NKC，标志物Il2rb、Klrk1，43个）。stereo-seq获得的细胞集群与基于scFAST-seq的细胞注释结果在对应细胞类型中表现出最高的皮尔逊相关性（图 S1），证实细胞身份鉴定结果具有足够准确性，可为后续分析提供可靠支撑。
DKD进程与TFA治疗过程中的转录调控图谱
随后，我们构建了转录调控网络，并在肾小球（Podo、PEC、SMC、EnC）、肾小管（DLH、ALH、CD-PC）及免疫细胞（Mac）中鉴定出多个在对照组与 DKD 组间存在显著差异的调控子，其中多数调控子可被IRB、TFA单独或共同调控（图 S2）。我们的前期研究已证实，多个调控子可通过特定的细胞间通讯通路，调控DKD中的关键病理过程，包括炎症反应、肾小管损伤、线粒体动力学及脂质代谢。在本研究的空间转录组数据中，调控子Jun、Stat1、Junb及Cebpb在ALH、CD-PC、DLH、EnC、PEC、SMC及Mac中呈现出一致的表达趋势（图 2A）。这些调控子在DKD组中的活性普遍较强，而在对照组、IRB组及TFA组中均受到抑制。相应的转录因子（TFs）（图 2B）及受体（图 2C）在各组间也表现出类似的表达模式。例如，在CD-PC、EnC、Mac、PEC及SMC中，Stat1调控子均受到IRB与TFA的负向调控。上游溯源分析显示，转录因子Stat1在CD-PC、EnC、PEC及Mac中同样被鉴定为差异表达基因。此外，其上游受体Itgb5（槲皮素的直接靶点）在Mac与CD-PC中受到TFA的负向调控（图 2D）。空间分析结果显示，转录因子Stat1在DKD样本的CD-PC中特异性呈现出密集的高强度表达模式，而对照组、IRB组及TFA组仅表现出稀疏的低水平表达；且DKD组中Stat1的密集表达区域与免疫细胞的分布区域共定位（图 2G）。该调控子的靶基因（TGs）具有显著的功能特异性，在不同细胞类型中与该转录因子共表达最强的50个靶基因富集结果显示：CD-PC 中Stat1调控子的靶基因主要富集于肽抗原结合、TAP结合及TAP复合物结合相关通路，而Mac中该调控子的靶基因则富集于整合素结合、趋化因子活性、细胞因子活性等免疫相关通路（图 2E）。免疫荧光染色结果显示，作为肾脏纤维化的重要标志物，α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在DKD组中的信号强度最高（图 2F），而对照组、IRB组及TFA组的荧光强度显著降低（图 2H）。
图2. 调控子活性、转录因子、受体表达、空间结构及功能富集的整合分析揭示TFA治疗DKD的机制基础
（A）棒棒糖图显示，黄葵胶囊（HKC）调控的7个核心调控子中，部分可被TFA和IRB共同调控。气泡大小代表与DKD组相比的差异分析P值。（B）调控子活性在各组间存在差异的转录因子（TF）在特定细胞类型中的表达水平。气泡大小表示阳性表达细胞比例，颜色深浅反映平均表达量。（C）气泡图展示（B）中转录因子对应的上游受体在各组相关细胞类型中的表达情况。（D）示意图总结4个受体调控的调控子在对照组、IRB组及TFA组相对于DKD组的上调或下调趋势。（E）基于各细胞类型中与转录因子Stat1呈最高斯皮尔曼相关性的靶基因，进行GO通路功能富集分析。在网络图中，紫色节点代表富集通路，绿色节点代表对应靶基因，字体大小反映基因表达水平。（F）α-SMA免疫荧光染色的代表性40倍光学显微镜视野。比例尺= 50 μm。（G）转录因子Stat1在CD-PC和Mac中的空间特征表达图谱。DKD组中Stat1表达显著升高，且在巨噬细胞中呈空间聚集分布，与该细胞类型的解剖学分布一致。（H）四组样本中α-SMA（绿色荧光）的积分光密度定量分析（先经Kruskal-Wallis检验确认存在显著差异，再采用Wilcoxon检验结合Bonferroni校正进行两两比较）。
本研究证实，TFA可通过调控DKD进展过程中典型的免疫细胞浸润及肾损伤，改善蛋白尿、肾纤维化、细胞外基质（ECM）沉积等DKD临床与病理特征。数据显示，TFA在DKD治疗中展现出与HKC及IRB相当的疗效，且TFA与IRB均能改善DKD相关的免疫应答及肾纤维化。值得注意的是，TFA中的七种主要黄酮类成分可协同抑制Tgfbr1通路，其中槲皮素可特异性抑制Itgb5-Stat1通路，进而在DKD中发挥保护作用（图 2D）。本研究从单细胞层面深化了对DKD发病机制的理解，并阐明了黄蜀葵治疗DKD的多项药理机制。Chen等人采用scRNA-seq结合10X Visium空间转录组技术分析DKD患者肾活检样本，发现血管内皮细胞、免疫细胞与纤维化区域存在空间相关性，尤其强调了成纤维细胞与近端小管细胞、集合管主细胞、足细胞三种关键细胞类型间的相互作用增强。10X Visium平台的主要局限性在于其55 μm的分辨率，该技术平台单个位点常包含内皮细胞、足细胞、系膜细胞等多种肾细胞类型，即使经过解卷积处理仍会降低数据准确性。Abedini等人利用分辨率超单细胞水平的10X Visium空间转录组技术绘制肾脏疾病（包括DKD）图谱并表征纤维化微环境，但该方法的空间分辨率仍局限于55 μm，可能限制对组织内更精细细胞结构或相互作用的解析。
在前期研究中，我们通过分子对接及scRNA-seq数据的共表达网络分析证实，TFA中的七种黄酮类成分可与Fgfr1, Itga1, Lrp5, Il12rb2, Itgb5, Klrc2, Itga3, Ldlr, Tgfbr1, and Nt5e等受体相互作用。这些相互作用通过靶基因共表达网络调控下游转录因子及调控子，最终影响与DKD相关的纤维化、脂质代谢、肾小管损伤等关键生物学通路。本研究进一步证实，具有特定化学组成的TFA制剂在DKD模型中展现出显著治疗效果。在下游调控子调控过程中，转录因子Jun、Junb、Stat1、Cebpb呈现出一致的调控模式，其上游受体Itga3, Itgb5, and Tgfbr1可被TFA直接或间接调控。值得注意的是，TFA与IRB治疗组中巨噬细胞的Itgb5表达均显著下调。作为SPP1通路介导细胞通讯的关键受体，Itgb5在调控细胞间相互作用中发挥重要作用；而SPP1通路的配体Spp1作为细胞外基质成分，积极参与免疫应答并促进纤维化进展。槲皮素对Itgb5的药理调控可有效抑制Stat1调控子活性，且实验验证显示，Foxo1介导的Stat1抑制可减轻糖尿病小鼠的肾小管间质纤维化、肾小管凋亡及足细胞损伤。TGF-β/Tgfbr1信号轴激活伴随α-SMA和FN1上调，这是肾纤维化的标志性特征；该信号轴可自主驱动细胞外基质及胶原沉积，因此抑制该通路成为 DKD的潜在治疗策略。计算分析进一步表明，TFA中七种主要黄酮类成分均可能与Tgfbr1发生分子相互作用，提示在DKD治疗中直接靶向这一关键受体的潜在可行性。
综上，本研究证实TFA可改善db/db小鼠DKD模型的病理状态，鉴定出与TFA治疗作用相关的关键肾脏受体及调控因子，为黄蜀葵花的临床应用提供了理论依据。
方 法
动物饲养与管理
10周龄db/db小鼠（BKS.Cg-Dock7m +/+ Leprdb/J）及杂合子非糖尿病对照db/m小鼠（BKS.Cg-Dock7m +/ Leprdb/+，对照组）购自华昌新诺医疗科技有限公司（中国泰州）。所有小鼠均为雄性，饲养于无特定病原体（SPF）屏障环境中（温度22-25℃；湿度40-50%；12小时光照/黑暗周期），自由采食标准饲料并饮水。
药物干预
16周龄时，db/db小鼠随机分为三组，每日经灌胃给予75.5 mg/kg体重的TFA（苏中药业研究院，TFA组）、20.0 mg/kg体重的IRB（赛诺菲制药（杭州）有限公司，IRB组）或等体积纯净水（DKD组）；db/m小鼠作为对照组，给药体积与方式同DKD组。TFA 为棕色粉末，按干燥品计算，每克粉末含芦丁2.4 mg、金丝桃苷189.6 mg、异槲皮苷188.7 mg、槲皮素-3-O-葡萄糖苷142.9 mg、杨梅素33.2 mg、槲皮素29.4 mg、槲皮素 - 3-O-洋槐双糖苷133.0 mg，水分含量为2.7%。
肾组织获取
20周龄时，采用颈椎脱臼法处死小鼠，经心脏灌注1× 磷酸盐缓冲液清除外周血细胞。每组取2只小鼠的左肾，包埋于最佳切割温度（OCT）复合物中，用于stereo-seq分析；取1只db/m小鼠的完整左肾及6只db/m小鼠的右肾，经肾小球富集后用于scFAST-seq文库构建。
病理生理学检测
将OCT包埋的冷冻组织通过冷冻切片机切成10 μm厚切片，进行苏木精-伊红（H&E）染色。采用配备数字成像系统的光学显微镜采集组织学图像。
空间转录组图谱的免疫荧光验证
为在蛋白水平验证空间转录组数据，对8 μm厚的OCT包埋冷冻组织切片进行免疫荧光染色，实验流程如下：（1）抗原修复；（2）非特异性位点封闭；（3）一抗孵育；（4）辣根过氧化物酶（HRP）标记二抗孵育；（5）酪酰胺信号放大（TSA）；（6）抗体剥离；（7）4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核；（8）封片。
全肾及富集肾小球的 scFAST-seq 文库构建
获取完整肾脏及富集肾小球后，用冰预冷的罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）细胞培养基（赛默飞世尔科技，RPMI1640）洗涤，按照制造商说明书使用多组织解离试剂盒2（美天旎生物技术，130-110-203）进行组织解离。采用裂解缓冲液（美天旎生物技术，130-094-183）裂解红细胞后，通过荧光细胞分析仪（Counterstar8 Rigel S2）结合吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）染色检测细胞活力。使用死细胞去除试剂盒及磁珠细胞分选系统（美天旎生物技术，130-109-398/130-090-101）去除死细胞并富集活细胞。最终，将新鲜细胞用RPMI细胞培养基（赛默飞世尔科技，RPMI1640）洗涤2次，重悬于含0.04%牛血清白蛋白的1×磷酸盐缓冲液中，调整细胞浓度至1×10⁶个/mL。
采用SeekOne®单细胞全转录组试剂盒（SeekGene，K00801）按照制造商protocol构建 scFAST-seq文库。简要步骤如下：将预设数量的细胞与逆转录试剂混合，加入SeekOne® DD芯片（SeekGene，S3）的样本孔中；随后向对应孔中加入条形码水凝胶珠（BHBs）及分隔油；通过SeekOne®数字微滴系统将含细胞的逆转录试剂与BHBs包裹成乳化微滴；对微滴进行热循环反应，通过PCR扩增实现cDNA条形码标记；采用定量PCR（KAPA Biosystems，KK4824）对条形码标记的cDNA进行纯化和定量；最终构建测序文库，在Illumina NovaSeq 6000平台进行双端150 bp测序。
scFAST-seq数据分析流程
使用Fastp（Version 0.20.1）对原始测序数据进行质量控制，包括去除接头序列、低质量及过短读长（<60 bp）的序列，并统计基本测序信息。清洁数据通过SeekSoul Tools（Version 1.0）流程处理生成转录本表达矩阵；将校正后的条形码及UMI与对应读长匹配，使用STAR（Version 2.5.1b）比对至参考基因组（mm10）；通过Subread软件包中的featureCounts工具将含条形码和UMI信息的读长分配至对应转录本。
在Python的Scanpy环境中，导入全肾及富集肾小球的单细胞RNA测序表达矩阵并创建AnnData对象，保留表达基因数> 200且至少在3个细胞中表达的基因。基于前期验证实验结果，保留总UMI计数< 6000且线粒体UMI占比≤22%的细胞。经数据标准化、降维、聚类及注释后，共鉴定出25个细胞集群（图 S2A）；根据经典标志物（图 S2C），将这些集群归类为16种细胞类型（图 S2B），包括PTC、DLH、ALH、DCT、CD-PC、CD-IC、EnC、PEC、Podo、SMC、MC、T 细胞、Mac、B 细胞、Neu及NKC。
基于stereo-seq平台的空间转录组文库构建
取8个OCT包埋的冷冻组织样本，在最大横截面处切成10 μm厚的冷冻切片。经检测所有样本的RNA质量数（RQN）>7且大于200核苷酸的双链RNA片段比例（DV200）>90%后，将切片转移至stereo-seq 芯片T载体（华大基因，200CT114）进行组织透化处理，透化时间如下：对照组样本1（24 分钟）、对照组样本2（24 分钟）、DKD组样本1（12 分钟）、DKD组样本2（12 分钟）、IRB组样本1（18 分钟）、IRB组样本2（12 分钟）、TFA组样本1（12 分钟）、TFA组样本2（12 分钟）。经单链DNA（ssDNA）染色、组织去除及逆转录后，采用AMPure® XP磁珠（Agencourt，产品编号 A63882）纯化cDNA；纯化产物经扩增后，使用stereo-seq文库构建试剂盒（华大基因，101KL114）构建文库；通过高通量测序引物试剂盒（华大基因，940-000037-00）制备DNA纳米球（DNBs），在MGISEQ-2000 平台进行测序，生成FASTQ文件。
stereo-seq原始数据转化为含空间坐标的单细胞表达矩阵
比对前，先过滤掉与参考基因组匹配率<20%的序列，再经严格质量控制去除低质量序列。使用SAW软件（Version 7.1）中的STAR算法将stereo-seq读长比对至mm10参考基因组以确保定位准确性，比对时允许1个碱基错配（以应对PCR扩增可能引入的误差），剔除质量值< 10的碱基数量>2个的读长，仅保留定位质量（MAPQ）值>10的读长并注释为对应基因的计数。最终生成含坐标ID（CID）信息的表达矩阵（.gem和.gef文件），作为后续基因表达分析的基础。
获取每个位点的表达矩阵后，SAW软件利用Scikit-image（Version 0.19.1）整合表达矩阵与ssDNA染色图像进行细胞分割（图 S3A），最终生成真正的单细胞水平空间转录组表达矩阵。
基于scFAST数据的stereo-seq细胞bin注释
采用稳健细胞类型分解（RCTD）方法将stereo-seq矩阵转化为单细胞矩阵：首先评估细胞分割结果，过滤掉非细胞单元及多细胞单元；在Python环境中将SAW软件输出的细胞bin GEF文件导出为h5ad格式，导入R语言；提取表达矩阵后，以前期获得的全肾及肾小球 scFAST 数据作为参考数据集，使用RCTD软件包的run.RCTD ()函数进行分析。后续分析仅保留RCTD鉴定的单细胞，排除双细胞及非细胞单元（图 S3B-D）；在基于RCTD的细胞质量判定过程中，将scFAST提供的细胞类型标签信息同时注释到空间表达矩阵中。
基于Wilcoxon检验，使用Seurat软件中的FindAllMarkers()函数鉴定每种细胞类型的标志物基因，选取每种细胞类型中差异倍数最高的10个基因；利用这些top10标志物基因，对scFAST和stereo-seq的标准化表达矩阵进行皮尔逊相关性分析。
转录因子推断
从每个样本中单独提取每种细胞类型（IRB组和TFA组中预测为对照组或 DKD组的细胞视为不同类别），采用两侧各10个细胞的滑动窗口扫描当前数据，对最近的9个细胞进行无放回分箱（每个分箱的特征数增加至791.38±287.63）。在R语言中，使用SCENIC（Version 1.3.1）及其依赖包（包括 GENIE3（Version 1.26.0）、RcisTarget（Version 1.24.1）和AUCell（Version 1.26.0））构建单细胞转录因子调控网络。为避免人为变异因素，将汇总的UMI计数作为GENIE3的输入数据，通过随机森林模型计算转录因子与潜在靶基因（TGs）的共表达关系；采用iRegulon 框架进行转录因子基序富集分析，使用i-cisTarget记录的序列基序文件（mm9-500bpupstream-7species.mc9nr.feather和mm9-tss-centered-10kb-7species.mc9nr.feather），聚焦转录起始位点（TSS）上下游10 kb及上游500 bp区域；保留标准化富集分数（NES）>3.0的显著调控子，通过AUCell软件包计算调控子的曲线下面积（AUC）得分。基于RcisTarget中转录因子与靶基因的对应关系及scMLnet中受体-转录因子的相互作用，构建受体-转录因子-靶基因调控网络；使用limma软件包（经验贝叶斯校正t检验）分析调控子AUC得分的差异；最终采用棒棒糖图可视化排名前50的显著差异调控子（若数量充足，设定p值 < 0.01）。
代码和数据可用性：
https://db.cng本研究支撑结论的原始数据已上传至中国国家基因库序列归档系统（链接：b.org/data_resources/project/CNP0008267），获取编号 CNP0008267。研究所用数据及分析脚本存储于https://github.com/Biomamba/iMeta2025。补充材料（图表、图文摘要、幻灯片、视频、中文版译文及更新材料）可通过在线DOI或iMeta Science官网（http://www.imeta.science/）获取。
引文格式：
Chenhua Wu, Haitao Tang, Yihong Yu, Yuhui Song, Haitao Ge, Yiming Shen, Jie Wu, et al. 2025. “Single-cell and spatial transcriptomics reveals potential molecular mechanisms of Abelmoschus manihot (L.) Medic in treating diabetic kidney disease.” iMeta 4: e70099. https://doi.org/10.1002/imt2.70099.
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吴晨华（第一作者）
●烟台毓璜顶医院副研究员，Biomamba生信基地创始人。
● 研究方向：聚焦糖尿病肾病、头颈鳞癌的多组学发病机制解析、生物信息学科研与教学传播。以第一作者身份在Phytomedicine、metabolites、International Journal of Molecular Sciences、Journal of Cell Communication and Signaling发表研究论文。创办Biomamba生信基地媒体矩阵，10万+同行关注，累计阅读量近千万。
Harvest F. Gu 顾丰（通讯作者）
● 中国药科大学基础医学与临床药学学院分子医学研究室 教授、博导（2019年起）。瑞典斯德哥尔摩卡罗琳斯卡医学院Rolf Luft糖尿病研究中心研究员、博导 （2019年前）兼中国医学科学院北京协和医学院、重庆医科大学、浙江大学医学院、南京医科大学、广西医科大学等讲席教授或客座教授。
● 科研方向：糖尿病、肥胖症和糖尿病肾病分子医学。已发表SCI论文260余篇，参编或主编英文专著5部。
吴洁（通讯作者）
● 中国药科大学生命科学与技术学院教授，博士生导师。
● 研究方向：新型疫苗；自身免疫性疾病发病机制及药靶发现。主持或参与国家自然科学基金、国家“863”、江苏省科技计划等国家、省部级项目多项。在Pharmacol Res, Diabetes, Journal of Controlled Release, Microbial Biotechnology等期刊发表论文50余篇。
唐海涛（通讯作者）
● 泰州学院药学院，博士，正高级工程师。
● 研究方向：从事中药新药创制、组分有效体、中药智能制造技术的研究；主持或参与国家重大新药创制计划、中医药现代化等国家、省部级项目多项。在Diabetes,Phytomedicine等期刊发表论文30余。
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“iMeta” 是由威立、宏科学和本领域数千名华人科学家合作出版的开放获取期刊，主编由中科院微生物所刘双江研究员和荷兰格罗宁根大学傅静远教授担任。目的是发表所有领域高影响力的研究、方法和综述，重点关注微生物组、生物信息、大数据和多组学等前沿交叉学科。目标是发表前10%(IF > 20)的高影响力论文。期刊特色包括中英双语图文、双语视频、可重复分析、图片打磨、60万用户的社交媒体宣传等。2022年2月正式创刊！相继被Google Scholar、PubMed、SCIE、ESI、DOAJ、Scopus等数据库收录！2025年6月影响因子33.2，中科院分区生物学1区Top，位列全球SCI期刊前千分之三(65/22249)，微生物学科2/163，仅低于Nature Reviews，学科研究类期刊全球第一，中国大陆5/585！
“iMetaOmics” 是“iMeta” 子刊，主编由中国科学院北京生命科学研究院赵方庆研究员和香港中文大学于君教授担任，目标是成为影响因子大于10的高水平综合期刊，欢迎投稿！
"iMetaMed" 是“iMeta” 子刊，专注于医学、健康和生物技术领域，目标是成为影响因子大于15的医学综合类期刊，欢迎投稿！
iMeta主页：
http://www.imeta.science
姊妹刊iMetaOmics主页：
http://www.imeta.science/imetaomics/
出版社iMeta主页：
https://onlinelibrary.wiley.com/journal/2770596x
出版社iMetaOmics主页：
https://onlinelibrary.wiley.com/journal/29969514
出版社iMetaMed主页：
https://onlinelibrary.wiley.com/journal/3066988x
iMeta投稿：
https://wiley.atyponrex.com/journal/IMT2
iMetaOmics投稿：
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https://wiley.atyponrex.com/submission/dashboard?siteName=IMM3
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