天然化合物菊苣酸是菊苣、蒲公英、紫锥菊等常用抗炎药用植物中极为重要的活性成分之一[1]，为一种天然多酚化合物。现代药理学研究表明，菊苣酸作为1种天然产物，具有抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等多种药理活性[1-3]。研究等发现[4]，菊苣酸可清除长期高脂饮食诱导的氧化应激产生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）积累，缓解机体氧化应激造成的氧化损伤，因此CA在增强机体免疫功能、缓解炎症等方面具有重要的药理作用。

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种炎症性疾病，被广泛认为与结肠屏障损伤和炎症反应有关[5]。持续的炎症反应促使白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎因子的产生，造成结肠屏障的破坏。在结肠炎症状态下，肠屏障被破坏，各种共生微生物、致病微生物和/或其代谢产物（如脂多糖、IL-6、IL-1β、TNF-α等）通过肠系膜静脉和门静脉输送到肝脏，刺激肝脏产生炎症损伤，而炎症性肝病反过来加剧UC形成恶性循环，因此肝损伤的治疗不容忽视。因此，本研究旨在探讨CA对硫酸葡聚糖钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导的UC小鼠继发性肝损伤的改善作用，以期为临床治疗该疾病提供新的思路。

1 材料

1.1动物

1.2 药品与试剂

1.3仪器

EG1150H+C型生物组织包埋机、RM2135型石蜡切片仪（德国徕卡仪器有限公司）；Pannoramic MIDI型数字切片扫描系统（匈牙利3DHISTECN公司）；AX2202ZH/E型电子天平（上海奥豪斯仪器有限公司；Synergy H4型全功能微孔板检测仪（美国Bioteck公司）；Axio VertA1型蔡司倒置荧光显微镜、Axio Imager Z2型蔡司正置荧光显微镜（德国卡尔蔡司公司）；5424R型冷冻离心机（德国eppendorf公司）；5200Multi型全自动化学发光分析仪（上海天能科技有限公司）；LightCycler 480 II型全自动荧光定量PCR系统（美国罗氏公司）。

2 方法

2.1动物分组、造模及给药

将35只小鼠随机分为对照组、模型组、5-ASA（150 mg/kg）组及菊苣酸低、高剂量（10、30 mg/kg）组，每组7只。适应性饲养7 d后，各给药组连续ig相应质量浓度药物3 d（10 mL/kg），对照组和模型组小鼠ig等体积生理盐水，期间自由饮用无菌水。随 后，除对照组外，其余4组均换成连续自由饮用新鲜的3.5% DSS溶液8 d，ig对应剂量的药物，1次/d，对照组和模型组小鼠ig等体积生理盐水。

2.2体质量变化及疾病活动指数（disease activity index，DAI）的评估

每天记录小鼠体质量及饮食、饮水量，观察小鼠活动状况、精神状态、粪便性状及小鼠粪便潜血评估，计算DAI。DAI评分标准见表1[6]。

2.3 样本采集

末次给药后，禁食不禁水24 h，称定体质量后麻醉小鼠，收集血液、结肠、肝脏、脾脏等组织，记录各组小鼠结肠长度、肝脏和脾脏质量。将一部分组织固定于4%多聚甲醛溶液中，用于组织切片染色；另一部分储存于−80 ℃，用于分子生物学检测。计算器官指数。

器官指数＝器官质量/体质量

2.4 肝脏病理学检测

将固定于多聚甲醛中的肝脏组织，流水冲洗，梯度脱水，浸蜡后包埋成蜡块。随后，制成4 μm石蜡切片，65 ℃下烘干2 h，梯度乙醇洗脱，二甲苯脱蜡，HE染色，封片，晾干，用数字切片扫描仪读取切片，观察肝脏组织的形态变化并评分。0分：肝细胞形态整齐，肝细胞索排列整齐，未见病理改变；1分：肝细胞索排列不整齐，出现紊乱，细胞内出现空泡，有轻微的炎性浸润；2分：肝小叶不清晰，细胞轻微固缩，细胞之间可见间隙，有较多的炎性浸润；3分：肝细胞明显固缩，细胞之间的间隙明显，有明显的炎性浸润[7]。

2.5肝脏组织纤维化检测

将各组脱蜡处理后的肝脏组织切片，按天狼星红染色试剂盒使用说明书染色后，用无水乙醇将多余的染色液冲洗干净，待乙醇挥发后，中性树脂封片，于显微镜下观察，拍照并记录分析。

2.6肝脏组织中AST、ALT、MDA、SOD含量检测

取小鼠肝脏组织，用预冷的PBS冲洗，按照肝脏组织与PBS体积比1∶9冰浴匀浆，3 000 r/min、4 ℃离心15 min，取上清。按照试剂盒说明书测定肝功能指标AST、ALT及氧化应激因子MDA、SOD水平。

2.7 血清中炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6含量测定

将全血室温静置30 min，2 500 r/min离心20 min，取上清，备用。采用ELISA法检测血清中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

2.8肝脏中脂质过氧化物（lipid peroxidation，LPO）和游离Fe2+检测

制作新鲜肝脏组织的冰冻切片，分别使用Liperfluo试剂盒及FerroOrange试剂盒检测肝脏组织中LPO及游离Fe2+，于荧光显微镜下观察荧光强度。

2.9 肝脏组织细胞凋亡检测

将肝脏组织石蜡块制作成3 μm切片并脱蜡至水，滴加含PI和Hochesst染料的工作液，置于37 ℃烘箱孵育30 min后，PBS洗涤3次，每次3 min，滴加含防淬灭剂的封片剂，在荧光显微镜下观察各组的荧光强度。

2.10 RT-PCR 检测肝脏中促炎因子的表达

取各组小鼠的新鲜肝脏组织，液氮研磨，使用TRIzol试剂提取各组RNA，再取1 μg逆转录成cDNA后，用SYBR Green进行荧光定量PCR检测，以β-actin为内参，采用2−ΔΔCt法计算IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA的相对表达量。内参及目的基因引物序列见表2。

2.11 Western blotting法检测肝脏组织中GPX4和p-NF-κB p65蛋白表达

取新鲜肝脏组织加入RIPA裂解液，于冰上提取组织中总蛋白并定量。调整蛋白样品浓度与上样缓冲液混匀并沸水浴加热变性后，蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，在质量浓度为5%脱脂奶粉中封闭1 h，TBST洗膜后加入一抗（1∶2 000），4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后再加入HRP标记的二抗（1∶3 000），室温孵育1 h，TBST洗膜后，采用ECL化学发光，以GAPDH为内标蛋白，使用Image-J分析软件计算各组GPX4、p-NF-κB p65蛋白相对表达水平。

2.12统计学分析

所有实验结果均以表示，每组数据至少来自3个独立性实验结果，使用GraphPad Prism 8.0统计学数据软件进行数据处理，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。

3结果

3.1对UC小鼠精神状态、体质量、饮食饮水量及DAI的影响

结果如图1所示。对照组小鼠精神状态良好、活泼好动、毛发润滑发亮，饮食饮水规律、大便成形、颜色正常、体质量稳定增长；与对照组比较，模型组小鼠精神萎靡、反应迟钝、蜷缩懒动、毛色暗淡、饮食饮水量随着造模时间的延长显著减少，并逐渐出现腹泻便血等症状，体质量显著下降，DAI值显著升高（P＜0.001）。与模型组比较，菊苣酸和5-ASA组小鼠精神状态有所好转，进食进水及活动量逐渐增加，大便形态及血便情况有所改善，DAI值显著降低（P＜0.01、0.001）。

3.2对UC小鼠结肠长度、脾脏指数及肝脏指数的影响

结果如图2所示。与对照组比较，模型组小鼠结肠长度显著缩短（P＜0.001），脾脏指数及肝脏指数均显著升高（P＜0.001），表明DSS诱导小鼠发生结肠炎，脾脏指数的升高，也说明小鼠体内炎症升高，同时肝脏也有一定程度的受损；与模型组比较，菊苣酸低、高剂量组和5-ASA组结肠长度显著增加（P＜0.05、0.01），脾脏指数及肝脏指数显著降低（P＜0.05、0.01），说明菊苣酸和5-ASA可以改善DSS诱导的UC小鼠体内炎症反应。

3.3 对肝脏病理学变化的影响

HE染色和天狼星红染色结果（图3）显示，在对照组中，肝细胞紧密排列，结构完整，偶见轻微自身纤维化现象；模型组肝细胞出现肿胀和松散排列的特征以及炎症浸润现象，纤维化现象明显；菊苣酸和5-ASA组小鼠肝细胞肿胀现象显著减轻，细胞排列变得紧密，炎症细胞浸润减少，纤维化面积减少，说明菊苣酸和5-ASA可以改善DSS诱导的UC小鼠肝损伤。

3.4 对UC小鼠肝脏中铁死亡相关的LPO及Fe2+积累的影响

结果如图4所示。与对照组比较，DSS组小鼠肝脏组织LPO（绿色荧光）和Fe2+（红色荧光）积累，荧光强度增强；与模型组比较，菊苣酸和5-ASA组小鼠肝脏组织脂质过氧化物和Fe2+积累减少。

3.5对UC小鼠肝脏组织中ROS含量的影响

结果如图5所示。与对照组比较，模型组小鼠肝脏组织ROS荧光强度（红色）升高；与模型组比较，菊苣酸组和5-ASA组小鼠肝脏组织ROS荧光强度降低，说明菊苣酸可以改善炎症诱导的肝脏组织中的氧化应激反应。

3.6 对UC小鼠肝脏组织AST、ALT、SOD和MDA水平的影响

结果如图6所示。与对照组比较，模型组小鼠肝脏组织AST、ALT、MDA水平显著升高（P＜0.01、0.001），SOD活性显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，菊苣酸组和5-ASA组小鼠肝脏组织AST、ALT、MDA水平显著降低（P＜0.05、0.01、0.001），SOD活性显著升高（P＜0.05、0.01）。

3.7对UC小鼠血清中炎症因子水平的影响

结果如图7所示。与对照组比较，模型组小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量显著升高（P＜0.001）；与模型组比较，菊苣酸组和5-ASA组小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量显著降低（P＜0.05、0.01、0.001）。

3.8 对UC小鼠肝脏中IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达水平的影响

结果如图8所示。与对照组比较，模型组小鼠肝脏组织IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达显著增加（P＜0.001）；与模型组比较，菊苣酸组和5-ASA组小鼠肝脏组织IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达显著降低（P＜0.001）。

3.9 对UC小鼠肝脏细胞凋亡的影响

结果如图9所示。与对照组比较，模型组小鼠肝脏组织凋亡细胞数量上升，红色荧光增强；与模型组比较，菊苣酸组和5-ASA组小鼠肝脏组织凋亡细胞数量下降，红色荧光减弱。

3.10对UC小鼠肝脏中GPX4和p-NF-κB p65蛋白表达的影响

结果如图10所示。与对照组比较，模型组小鼠肝脏组织GPX4表达显著下调（P＜0.001），p-NF-κB p65蛋白表达显著上调（P＜0.001）；与模型组比较，菊苣酸组和5-ASA组小鼠肝脏组织GPX4表达显著上调（P＜0.05、0.01），p-NF-κB p65蛋白表达显著下调（P＜0.05、0.01）。

4讨论

UC是临床上发病率较高的多因素的难治性慢性疾病，以肠屏障损伤为特征，临床上表现为反复腹痛、腹泻、脓血便，这些严重影响患者的生活质量[8]。5-ASA是临床用于治疗轻-中度溃疡性结肠炎患者的一线药品，可以通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ或阻断NF-κB通路来减轻结肠炎[9-10]。因此，本研究中采用5-ASA作为阳性对照药物，对比评价菊苣酸的药理作用。本研究通过小鼠自由饮用新鲜DSS溶液复制慢性UC模型，模拟UC的发病过程及临床表现。结果显示，菊苣酸可以改善DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎症状，表明CA可以缓解DSS诱导的结肠炎以及由此引起的体内炎症反应。

继发性肝损伤是溃疡性结肠炎的肠外表现之一[11]。临床溃疡性结肠炎治疗中，异质性的肝功能表现常被忽视，但UC诱导肝损伤的确切机制尚不清楚。许多研究表明，炎症在UC的发病机制中起着关键作用，并且有证据表明溃疡性结肠炎和炎症性肝病之间存在重要相关性[12]。UC产生的IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎因子，通过门静脉传输到肝脏，会引起肝脏发生急性损伤[13]。ALT和AST作为反映肝功能状态与肝细胞损伤的指标，已被广泛用于评估慢性肝炎、肝纤维化以及肝硬化等肝脏疾病的严重程度[14]。当肝脏受到损伤时，肝脏细胞中AST和ALT活性升高[15]。本研究结果显示，模型组小鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6含量上升，肝脏组织中AST、ALT水平升高，菊苣酸能不同程度的降低小鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6含量和小鼠肝脏中AST、ALT水平，对改善体内炎症以及肝损伤功能有显著的作用。肝脏炎症与氧化应激和脂质过氧化、炎症因子的释放、线粒体功能障碍等多种因素紧密相关，而氧化应激在肝脏损伤的发生、发展过程中起着关键作用[16]。MDA作为生物体脂质过氧化的标志物，可引起细胞肿胀、坏死[17]。SOD是细胞内抵抗氧化应激最重要的一种酶，能很好的清除自由基，对抗氧化应激，使机体免受氧化的损伤[18]。氧化应激下ROS的倍增可导致TNF-α、IL-6等促炎因子的释放，加重炎症反应，进一步损害肝功能，加速疾病的进程，引起肝脏纤维化的发生[19]。本研究发现，DSS诱导的UC小鼠肝脏指数升高、炎症细胞浸润、纤维化明显、MDA水平上升，而SOD活性降低，提示模型组小鼠肝脏发生炎症。而给与菊苣酸或5-ASA治疗后可以降低炎症引发的肝脏肿胀、减少炎症细胞浸润、纤维化现象、MDA水平下降，而SOD活性升高，说明菊苣酸对DSS诱导的UC小鼠继发性肝损伤以及肝功能具有改善作用，提示菊苣酸可通过改善氧化应激损伤起到保护肝脏的作用。

自2012年“铁死亡”现象被揭示以来，众多国内外学者证实炎症过程中伴随着铁死亡的发生。铁死亡是一种新型的细胞死亡方式，铁依赖性脂质过氧化以及谷胱甘肽系统的调控核心酶GPX4活性降低是其显著特征[20]。细胞内不稳定铁池，主要以Fe2+的形式存在，由于Fe2+的不稳定性和高反应活性，可以通过芬顿反应产生羟自由基，并直接与细胞膜、质膜中的多不饱和脂肪酸反应，产生大量脂质ROS，导致细胞死亡。因此，铁死亡表现为脂质过氧化增高、ROS升高、铁离子聚集。本研究发现，模型组小鼠肝脏表现出ROS含量上升、脂质过氧化增高、铁离子聚集、细胞凋亡增多，同时GPX4蛋白表达下调；而菊苣酸可以有效改善肝脏铁死亡现象。

NF-κB p65在细胞应对炎症反应、损伤、应激等过程中发挥重要作用。磷酸化的NF-κB p65会被转移到细胞核并促进促炎细胞因子的转录，继而增加促炎因子的产生和释放[21]。本研究中，模型组p-NF-κB p65蛋白表达上调，炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达水平升高，而 菊苣酸可以抑制 p-NF-κB p65蛋白以及IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子mRNA的表达，进一步说明CA可以改善肝脏炎症反应。

综上， 菊苣酸可以缓解 UC引发的继发性肝损伤，其机制可能与CA降低血清中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量，抑制肝脏中Fe2+及脂质体的积累，上调铁死亡中关键蛋白GPX4及抑制炎症通路中NF-κB p65的磷酸化表达，从而起到抗炎及抑制铁死亡的作用。本研究为 菊苣酸改善因溃疡性结肠炎而引发的肝损伤的治疗提供了新的见解，也为 菊苣酸抗炎作用提供了实验依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）