近年来，空间转录组在临床医学和生命科学研究中的作用越来越显著，先后被Nature Methods(2020)、Nature(2022)评为年度应用技术。为了让更多想要进行空间转录组项目的科研工作者对其实验有个初步的了解。今天小编整理了一些常见的问题，按照样本准备、冷冻包埋、切片质检、组织优化、基因表达五个部分，一一为各位老师解答。

样本准备

Q1

哪些动植物组织适合做空间转录组？

动物：肝脏、肾脏、肠道、胚胎、大脑、胃、胆管、肺、心脏、血管、肌肉、膀胱、卵巢、脊髓、眼球、幼虫(昆虫)等重要组织器官。

植物：草本或木本植物的花苞、幼芽，幼嫩的果实或种子，愈伤组织等。

Tips：上述仅为部分组织举例，由于不同物种差异较大，不局限于上述组织。

Q2

做空间转录组，我该如何准备实验样本？

• 样本类型

OCT包埋的冷冻块(动植物)或FFPE样本(仅限人、鼠)，动物可采用异戊烷或者干冰冷冻，植物依据组织不同采用合适的包埋方法。

• 样本大小

样本大小：≤6.5/6.8 mm3 , 厚度满足1 mm以上，组织截面覆盖小于芯片捕获区域的25%，建议多个组织包埋至一个包埋块中，组织间隔尽量小且不重叠，多个组织保持在一个水平面充分利用捕获区域。

• 备份

植物： 需要3-5个包埋块/样（质检、切片厚度调整、捕获区域确定）

动物： 需要>3个包埋块/样（质检、组织透化、备份）

不同组织覆盖区域的样品展示

Q3

是否只要包埋盒能容纳组织，就不会超出芯片捕获区范围？

百创S1000平台芯片的捕获区大小是6.8x6.8mm，10x Visium平台芯片的捕获区大小是6.5x6.5mm。用于冷冻包埋的包埋盒厂商规格是7*7*5mm，但其实际的尺寸为10*10*5mm。如果完全按包埋盒的大小裁剪组织，将包埋盒填满组织，不留空隙，可能会导致组织超出芯片的捕获区域，影响后续实验。所以，太大的组织尽量裁剪成6.5x6.5/6.8x6.8m m2大小，并去除组织目标区域之外的其余组织。

百创S1000和10x Visium芯片组成

冷冻包埋

Q4

动植物冷冻包埋有哪些方法？

动物：

植物：

详细包埋实验方法可以扫描文末二维码联系我们领取《百迈客空间转录组样本准备指南》。

Q5

为什么花苞、幼芽这类组织需要抽真空处理？

植物花苞、幼芽组织空隙较多，如果不进行抽真空处理，在展片的步骤组织有可能会脱落。切片时，组织空隙没有OCT支撑会导致组织出现破碎。可以将内部空隙多的组织部分切开，让OCT进入组织空隙起到支撑的作用，降低后续实验失败的风险。

切片质检

Q6

切片厚度是固定的吗？

不是，大部分动物组织的细胞大小在10μm左右，我们切片厚度会选取10μm。植物细胞往往比动物细胞稍大一些，因此会根据组织类型对切片厚度进行测试和调整。

不同植物组织切片展示

Q7

我该如何从切片上辨别组织形态结构？

为了能够清晰地辨别出组织结构，以辅助判断所关注的结构或细胞类型是否存在以及状态如何，我们会对组织切片进行染色。动物组织采用HE染色，即苏木精—伊红染色。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。植物组织采用甲苯胺蓝染色，甲苯胺蓝是一种多色碱性染料，可使植物组织和细胞的不同成分染成不同的颜色。木质化部分呈蓝绿色，韧皮部呈蓝紫色，其他部分呈浅的蓝绿色。

Q8

我怎么知道样品的RNA有没有降解？

我们一般会取10-15片组织切片进行RNA抽提并质检，确定组织中RNA完整性（RIN＞7.0合格）。

Q9

为什么有些植物组织容易脱片呢？

部分植物组织纤维化程度高或淀粉含量高，与玻片的粘附性差，后续组织优化和基因表达均在液体环境中进行，容易发生脱片。

Q10

植物组织切片脱片有什么好的解决方法吗，如果脱片会影响实验结果吗？

尽量选择纤维化程度低、淀粉含量低的幼嫩时期样本来做空间转录组。当切片质检或组织优化时就出现脱片现象，后续正式实验极大可能再次发生脱片影响实验正常进行。如果前期实验均未脱片，基因表达阶段已经透化一段时间后才出现的脱片，此时绝大部分mRNA已经透化下来被对应位置的引物所捕获，如果聚类结果与形态结构吻合是不影响后续结果分析的。

组织优化

Q11

组织优化如何选择最佳时间点，有哪些注意事项？

对动植物组织进行组织优化时，通过酶处理的时间梯度和荧光标记的 cDNA信号强度，来确定最佳的透化时间。选择荧光信号强度最高、弥散最小的透化时间点作为后续正式基因表达实验的最佳时间点。

• 一般同一种组织类型，多指生物学重复样本组织透化做一次即可；
• 存在差异样本均需要组织优化：不同物种、组织、时期、厚度、切片、位置、染色等；
• 百迈客已经积累大量经验，创建动植物组织优化标准体系，保证组织优化结果准确判读，可供高质量的报告数据。

不同透化时间的动植物切片样本

基因表达

Q12

做基因表达实验的组织切片和切片预实验的是同一张切片吗？

不是，空间转录组实验流程中，每一步都要重新从包埋块切片，而不是直接从切好的片中找，每次贴到芯片上的都是新的切片。

Q13

已经贴到表达玻片上的样本不是我想要的，能取下重新贴吗？

不可以，已经贴片的样本和表达玻片紧密地粘附在一起，无法完整地取下，强行取下切片后会使spot点上的引物脱落，影响实验的准确性。

以上，就是本次关于空间转录组实验常见问题解答的全部内容了，如果还有其他关于空间转录组的疑问，欢迎各位老师留言！

百迈客提供高质量空间转录组测序服务

空间转录组从组织切片、染色到组织透化的实验过程，也直接关系到分析数据的质量，经过多年潜心研发与项目累积，百迈客已具备大量物种经验，创建了动植物组织优化标准体系，保证组织优化结果准确判读，可提供高质量的报告数据。目前实测组织类型100+，包括人、小鼠、大鼠等物种的肿瘤样本、胚胎样本、肝脏样本、肺部样本、脑部样本等；蝴蝶兰、拟南芥、番茄、菊花、白菜等物种的花苞、幼芽、愈伤组织等。此外，更是突破了动物血管、软骨、皮肤类组织的切片/透化难点，为高质量数据分析提供了保障。

百迈客空间转录组项目经验

百创S1000成功案例展示

1

某动物大脑

2

某动物泌尿器官

3

某动物肠道

4

免疫器官肿瘤

文：百迈客科技服务

排版：市场部

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百迈客生物(BioMarker)成立于2009年5月，是一家高新技术企业，公司基于功能基因组学的BT+IT(高通量基因测序技术、生物信息技术、高性能生物云计算技术)技术，拓展出了科技服务、生物云平台、智能制造三大业务板块；拥有以博士和硕士为主体的研发、生产团队；公司自成立以来，注重创新发展，科研成果成果层出不穷，先后在《Nature》、《Cell》、《Nature Genetics》等国际著名期刊上发表高质量合作文章近千篇，累计影响因子超过8000分。获得国家授权发明专利23项，软件著作权近200项。公司拥有Illumina、PacBio、Nanopore、BioNano、AB SCIEIX QTRAP, Waters Q-TOF等全面的测序平台，满足科研工作者多种科研需求，努力打造基因产业国际一流企业，“为世界创造新的可能！”