实验室细胞培养污染问题经常容易发生，细菌，真菌等污染比较容易发现。而支原体污染是隐匿性质的，不容易被肉眼观察到。所以实验室细胞系支原体污染的平均比例为30-90%。

一支原体介绍

直径约为0.1-0.3μm，且具有变形能力，可透过常见的过滤头（0.22-0.45 μm），因此常规的过滤除菌的方法不能将其去除，细胞常用的抗生素（青霉素、链霉素）也对支原体无效。

细胞外的支原体

二 支原体污染来源

（1）细胞之间交叉污染；

（2）细胞培养操作人员的口腔、皮肤等；

（3）工作环境或实验器材的污染物；

（4）血清的污染；

（5）原代分离的组织已有支原体污染等原因。

三 支原体的危害

（1）细胞外形可以没有明显的变化，支原体可以与细胞共存，污染后细胞液不会死亡，培养基一般不发生浑浊；

（2）使用被支原体污染的细胞做实验会严重影响实验的结果，因为支原体会抑制细胞生长，导致染色体畸变；细胞膜抗原性改变；细胞复苏后存活率降低等。

（3）影响细胞的代谢和功能：培养液中的精氨酸被支原体大量消耗，引起细胞蛋白质、DNA、rRNA、mRNA的合成障碍；支原体活动使培养液成分发生改变（如发酵型支原体降解糖类产生酸性物质），影响细胞代谢。

（4）培养过程中细胞破碎较多，培养基pH变化明显，需要频繁更换新鲜培养基；

（5）细胞被支原体污染后会形成共生体系导致污染不断扩大。

（6）比如RNAi/过表达实验结果不可重复，病毒包装失败等

四 支原体的检测

DNA荧光染色法， 聚合酶链反应(PCR)法， 电子显微镜法 ，相差显微镜检测 ，3-H胸腺嘧啶掺入法， 酶联免疫吸附试验、免疫荧光法 ，低张处理地衣红染色观察等等

实验室比较好操作的常用方法有两种：dapi染色检测和PCR检测

（1）dapi染色检测

细胞爬片或者直接传细胞到24孔板，第二天用1ug/mL的dapi染液 ，10min后用PBS洗去多余的dapi,用多聚甲醛或者甲醇固定。荧光显微镜观察。

污染的细胞 核周会有点状或者丝状的染色

2）PCR检测

支原体检测试剂盒

通过PCR方法检测培养细胞等生物材料中的支原体，所用引物为根据支原体 16S-23S rRNA 序列保守区域设计，只特异性扩增支原体DNA，检出灵敏度与特异性均较高。PCR 扩增及电泳分析只需数个小时，操作方便简单

五 支原体的去除

我司的支原体去除试剂盒经过了上百种细胞的测试和长期的实验验证，仅12小时就可以显著抑制支原体生长，1-2周左右即可清除支原体污染，且不影响细胞本身的代谢，完美兼具特异性和高效清除支原体的特点，且对细胞温和无损伤，最大程度上挽救您的珍贵细胞。

使用方法

1）从-20℃冰箱内取出试剂，轻轻漩涡混匀并用75%的酒精喷洒试剂管的表面，在超净工作台上进行无菌操作；

2）对于已检测或怀疑有支原体污染的细胞分盘后，每10ml培养基中加入10µl Mycoplasma Elimination Reagent溶液培养7天，期间需换液时按同等比例加入。

3）连续加药培养1周后，检测是否还存在支原体污染。如果还存在支原体污染，可继续培养1-2周。

六 如何避免支原体污染

如何避免支原体污染

预防是防止细胞培养过程中发生污染的较好办法。只有预防工作做在前，才能将发生污染的可能性降到较小程度。

1. 保证清洁无菌的工作环境

常规清洗地面和台面；定期清洁水浴锅；CO2 培养箱定期清洗、消毒和擦拭；生物安全柜每次使用后清洁及消毒。

2. 试剂耗材灭菌消毒与保存

细胞培养所用各种溶液，耗材灭菌除菌要仔细，确保无菌污染。

3. 规范的无菌操作

工作开始要先用75%酒精消毒手部以及袖口、瓶口等；在进行多种细胞培养操作时，所用器具（如移液枪等）要严格区分；在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细菌带到培养液中污染其他细胞。细胞培养实验室应制定严格的管理制度，按照规范的实验程序操作。

4. 合理利用抗生素

过度依赖抗生素会让人们忽略无菌操作，过度抗生素常也会导致耐药菌的产生。

5. 制定规范的制度

一般只允许相关人员才可进入细胞培养区，细胞培养区需和其他区域分开，且每个细胞培养区应布局合理，保证所需物品就近放置，在处理细胞时避免不必要的走动，细胞培养区应避免使用水池，从而避免微生物污染。

学会辨别和处理支原体污染是一项不可或缺的实验技能，希望大家在看完本文后结合自己实验操作，学会如何应对细胞支原体污染。

References

1. Olarerin-George, A. O. & Hogenesch, J. B. Preprint at bioRχiv http://dx.doi.org/10.1101/007054 (2014).

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