当小鼠暴露在外部温暖环境中时，视前区中值和内侧（MnPO/MPO）下丘脑的一氧化氮合酶（NOS1）神经元会诱导睡眠，并伴随身体降温。然而，这些神经元如何调节基础睡眠和体温尚不清楚。通过钙光度法，我们发现 MnPO/MPO 中的 NOS1 神经元在非快速眼动（NREM）睡眠和快速眼动（REM）睡眠期间主要处于活跃状态，尤其是在从清醒状态向 NREM 睡眠状态转换的边界阶段，以及在 REM 睡眠周期的后期，而在清醒期间活动度较低。除了释放一氧化氮外，MnPO/MPO 中的 NOS1 神经元还可以释放 γ- 氨基丁酸（GABA）、谷氨酸和肽类物质。我们在 MnPO/MPO NOS1 细胞中表达破伤风毒素轻链，以减少神经递质的囊泡释放。这引发了睡眠结构的变化：在 24 小时内，小鼠在黑暗（活跃）阶段的 NREM 睡眠时间减少，而在光照（睡眠）阶段的 NREM 睡眠时间增加。黑暗阶段的 REM 睡眠周期更长，并且在其他警觉状态之间的 REM 转换次数更少。REM 睡眠的 θ 波功率更低。与对照组小鼠相比，在明暗转换（ZT0）时以及在黑暗阶段的午睡时间（ZT16-20）（通常在这个时间段体温会下降），突触被阻断的 MnPO/MPO NOS1 神经元的小鼠体温也更高。此外，在这个体温下降的午睡时间点，小鼠通常会有更多的 NREM 睡眠，但突触被阻断的 MnPO/MPO NOS1 细胞的小鼠在这个时候的 NREM 睡眠减少。总体而言，MnPO/MPO NOS1 神经元促进 NREM 睡眠和 REM 睡眠，并有助于长期降低体温，特别是在小鼠通常进入 NREM 睡眠的转换阶段。

一、引言

大脑中分散的众多神经回路会诱导 NREM 睡眠，但视前区（PO）下丘脑是最早被确定的促进睡眠的中枢之一，它起着主要作用。PO 区域还包含 REM 睡眠所需的神经元，包括 MPO 中促进 REM 睡眠的细胞。PO 区域包含种类繁多的细胞，它还对调节许多其他功能有贡献，包括筑巢、体温调节、养育行为、性行为、饮水、血液渗透压和日常蛰伏。

通过艾伦脑图谱的原位杂交以及研究人员们之前的研究可以发现，内侧（M）和中值（Mn）PO 下丘脑区域富含神经元型一氧化氮（nos1）基因表达。之前研究人员们发现，MnPO 和 MPO 区域的 NOS1 神经元将 NREM 睡眠的开始与睡眠时伴随的体温下降联系起来。研究人员们假设，通过这些神经元进行的外部温暖感知和 NREM 睡眠诱导可能是一种能量保存机制的一部分，该机制使睡眠朝着热中性温度进行优化。

除了在受到兴奋和钙刺激时可能合成一氧化氮外，根据亚型的不同，MnPO/MPO NOS1 细胞可能会释放 GABA 和谷氨酸以及 / 或者各种肽类物质。在这里，通过钙光度法研究人员们发现，MnPO/MPO 中的 NOS1 神经元在 NREM 睡眠期间活性最高，在从清醒状态向 NREM 睡眠状态转换的边界阶段尤其活跃，并且它们在 REM 睡眠周期的后期也处于活跃状态。用破伤风毒素轻链（TeLC）表达对 MnPO/MPO NOS1 细胞进行突触沉默，诱导了 NREM 睡眠结构的双向变化：在 24 小时周期内，小鼠在黑暗阶段的 NREM 睡眠时间减少，在光照阶段的 NREM 睡眠时间增加。黑暗阶段的 REM 睡眠也整合为更长的周期，REM 转换次数减少；然而，与对照组相比，光照和黑暗阶段的 REM 睡眠都有更多的 δ 波和更少的 θ 波功率，这可能表明 REM 功能受到了干扰。此外，还观察到核心体温曲线向更高温度偏移以及午睡时间（ZT16-20）被打乱。因此，MnPO/MPO 下丘脑 NOS1 神经元的神经递质囊泡释放对于维持正常的睡眠和体温状态是必要的。

二、材料与方法

01. 小鼠

实验是根据《动物（科学程序）法案》（1986 年）进行的，并得到了当地伦理委员会的批准。所使用的小鼠为 Nos1-ires-CreTM 1 (crE) Mgmj/J，在此称为 Nos1-Cre 小鼠，由研究人员捐赠，以及 C57BL/6J 小鼠。实验中使用的所有小鼠均为雄性，且以 C57BL/6J 为背景的同基因小鼠。小鼠饲养在恒温（22±1°C）和恒湿环境中，采用反向的 12 小时光照：12 小时黑暗循环，自由进食和饮水。

02. 腺相关病毒（AAV）转基因和 AAV 的生产

我们使用了以下 pAAV 转基因质粒：pAAV-FLEX-GFP-TeLC，以及 pAAV-FLEX-GFP。质粒 pAAV-FLEX-GCaMP6s 是通过将来自 pCMV-GCaMP6s 的 GCaMP6s 开放阅读框，插入到 pAAV-flex-hM3Dq-mCHERRY 的骨架中，替代 hM3Dq 序列，但保留 loxP 位点而构建的。AAV 转基因在内部被包装到衣壳中，AAV1 和 AAV2 衣壳蛋白的比例为 1:1。辅助质粒、AAV 辅助质粒和 pAAV 转基因质粒共转染到 HEK293 细胞中，并且 AAV 通过柱收集。AAV 滴度使用滴定试剂盒测定。病毒滴度如下：AAV-FLEX-GCaMP6s，1.6×10^(6) 病毒基因组 / 微升；AAV-FLEX-GFP-TeLC 5.1×10^(5) 病毒基因组 / 微升；AAV-FLEX-GFP，6.1×10^(6) 病毒基因组 / 微升。

03. AAV 的手术和立体定位注射

小鼠在 10 周龄时接受第一次手术。小鼠需要进行两轮手术，包括植入腹部温度记录仪，一周后进行 AAV 病毒的立体定位注射和脑电图（ECoG）电极放置。手术时，小鼠用 2% 的异氟烷麻醉，并给予适当的镇痛药物。病毒输注使用钢注射器并借助电子泵进行。针对目标优化注射，注射体积在 0.05 至 0.2 微升之间，注射速度为 0.1 微升 / 分钟。相对于前囟的注射坐标为：前后（AP）+0.34 毫米，内外侧（ML）0 毫米，背腹侧（DV）-4.8 和 -5.2 毫米。在记录脑电图之前，至少允许有一周的恢复时间。

04. 脑电图（EEG）和肌电图（EMG）记录、警觉状态评分和功率谱分析

使用设备从无束缚的动物身上记录 EEG 和 EMG，方法如先前所述，电极放置在与研究人员之前工作相同的位置。这些位置为：相对于前囟，AP +1.5 毫米，ML -1.5 毫米，第一个 - AP -1.5 毫米，ML +1.5 相对于前囟，第二个 - 枕骨隆突 -1.0 毫米，ML 0.0 毫米。EMG 线也植入颈部肌肉中。数据以 200 赫兹的采样率记录，过采样四倍。使用软件分析 EEG 数据。在进行睡眠评分之前，ECoG 进行数字滤波（高通，0.5 赫兹，-3dB），EMG 进行带通滤波（5 - 45 赫兹，-3dB）。计算 δ（1 - 4 赫兹）和 θ（6 - 9 赫兹）频段的功率，以及 EMG 信号的均方根值（在 5 秒内平均），并使用自动脚本 OSD7 v7.2 来定义清醒、NREM 和 REM 的警觉状态。然后手动重新检查每个警觉状态。按照先前描述的方法，在对每只小鼠内的清醒功率进行归一化后，分析睡眠状态特定的功率谱。

05. 光度测量记录

使用带有光纤耦合器的 473 纳米二极管泵浦固态（DPSS）激光器和可调电源进行光度测量，由刺激器控制。锁相放大器使用 125 赫兹的 TTL 信号驱动激光器，光纤尖端的平均功率为 80 微瓦。使用光纤跳线，光源通过荧光立方体，然后通过第二根光纤跳线，通过陶瓷套管连接到植入大脑的光纤。然后 GCaMP6s 的输出在 500 - 550 纳米处进行滤波，传递到光电二极管，并由锁相放大器放大。信号使用软件以 200 赫兹的频率记录在设备上。最大连续记录长度为 6 小时。光度测量、EEG 和 EMG 数据使用软件进行离线对齐，并使用该软件或自定义脚本进行分析。使用软件进行峰值计数，当紧接着至少下降阈值幅度（100 微伏）且在检测间隔最小为 10 毫秒之外时，计算 “峰值”。对于每次转换，使用函数 ΔF/F = (F−F0)/F0 将光度测量信号 F 归一化为基线，其中 F0 是转换前的基线荧光。数据以百分比表示。热图显示为 Z 分数。与记录伪影或基线（直流偏移）的大偏移重合的转换被排除。

06. 温度记录

如先前所述，使用植入腹部的温度记录仪（DSTnano，Star-Oddi）测量核心体温，每 2 分钟采样一次。

07. 免疫组织化学

给小鼠注射戊巴比妥（100 毫克 / 千克体重；腹腔注射），并经心脏灌注 4% 的多聚甲醛（溶于磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4）。取出大脑，使用切片机切出 40 微米厚的冠状切片。在自由漂浮的切片上进行染色，用 PBS 洗涤三次，在含 0.4% Triton X-100 的 PBS 中通透 30 分钟，在含 10% 正常山羊血清（NGS）、0.2% Triton X-100 的 PBS 中孵育 1 小时进行封闭（均在室温下），随后用 1:1000 稀释的抗 GFP 多克隆抗体孵育过夜。切片在 PBS 中洗涤三次，然后与山羊抗兔 IgG（H + L）二抗，Alexa Fluor® 488 偶联物孵育 2 小时。然后样品洗涤六次，再用含 DAPI 的封片剂封片。

08. 统计学分析

数据收集要么是随机进行的，要么是以平衡的方式进行的。除非另有说明，数据表示为平均值 ± 标准误差（SEM）。使用软件进行统计分析。对于不独立的数据（不适合进行方差分析的情况），我们采用双尾或配对 t 检验，然后使用程序以 5% 的错误发现率进行多重比较校正。如果组织学检查未确认 AAV 转基因在 MnPO/MPO 区域的表达，或者表达扩散到目标区域之外，则将小鼠排除在分析之外。研究人员未对行为处理组设盲。

三、结果

01. 内侧视前区一氧化氮合酶 1 神经元在非快速眼动睡眠期间最为活跃

我们使用钙光度法来评估内侧视前区（MPO）中一氧化氮合酶 1（NOS1）神经元在睡眠 - 觉醒状态下的活动情况。将腺相关病毒（AAV）-FLEX-GCaMP6s 注射到 Nos1-Cre 小鼠的视前区中值和内侧（MnPO/MPO）区域，以产生 Nos1-MnPO/MPO-GCaMP6s 小鼠（图 1A、B）。然后，我们在小鼠于其饲养笼中自由活动时，记录了 6 小时内的钙光度信号。MnPO/MPO 区域的许多 NOS1 神经元在非快速眼动（NREM）睡眠期间处于活跃状态，在 NREM 睡眠中其钙活性最高，而在清醒期间仅有零星的活动。图 1C 展示了一个向 NREM 睡眠转换的 6 分钟时间段的示例，同时还展示了原始光度信号、δ 波功率（1 - 4 赫兹）、0 至 20 赫兹的频谱图、脑电图（EEG）、肌电图（EMG）以及睡眠状态评分。在清醒期间，仅能看到低水平的钙诱导荧光信号（在图 1C 的轴上标记为 “F”），并且信号中的峰值很少出现。虽然在清醒期间偶尔会出现钙信号的小峰值，但钙信号中峰值频率的特定增加与 NREM 睡眠相关。图 1D 以光栅图的形式展示了 6 分钟内十次转换的情况，并在图 1E 中进行了量化。在 NREM 睡眠期间，出现了更高的 GCaMP6s 信号水平和更频繁的峰值。图 1F 展示了四个示例光度曲线，并根据睡眠状态进行了颜色编码。每个示例上方都显示了峰值计数。

图1. MnPO/MPO 下丘脑的 NOS1 神经元在睡眠期间更为活跃。对动物在从熄灯到亮灯的 6 小时光照周期内进行记录，以促进睡眠状态的分布。转换情况展示在 300 秒内。（A）在 5 毫米深度进行光度测量的示意图，以及在 Nos1-MnPO/MPO-GCaMP6s 小鼠中 GCaMP6 表达位点的示例。（B）通过用 GFP 抗血清进行免疫细胞化学检测，显示 MnPO/MPO 下丘脑中神经元的 GCaMP6s 表达。（C）从清醒到 NREM 在 6 分钟间隔内的转换示例。还展示了睡眠状态评分（清醒，W；非快速眼动，N；快速眼动，R）、滤波后的 EEG 和 EMG、随时间变化的频域功率频谱图（赫兹）、具有 5 秒均方根（RMS）的 δ 波功率（1 - 4 赫兹）、原始光度信号（标记为 F）以及对光度信号的自动峰值计数（峰值）。（D）从清醒到 NREM 转换期间，对钙光度信号进行自动尖峰计数的光栅图。（E）清醒和 NREM 之间钙信号软转换的曲线下面积（ΔF/F）（配对 t 检验，n = 5，p = 0.0001）。（F）在 5 分钟内四个示例转换的原始光度数据及配对的自动峰值计数，按睡眠状态进行颜色编码。清醒显示为蓝色，NREM 显示为绿色。每条曲线上方标记了钙信号的峰值。（G）在清醒 - NREM 转换中增加的软类型转换的钙信号平均 ΔF/F，以及以热图形式表示的十个示例转换。（H）清醒和 NREM 之间软转换的 ΔF/F 曲线下面积（配对 t 检验，n = 5，p = 0.002）。（I）清醒 - NREM 转换中钙信号急剧增加并在恢复到基线之前的平均 ΔF/F，随后是以热图形式表示的十个示例转换。（J）清醒（基线）和 NREM（峰值）之间钙信号急剧转换的平均 ΔF/F（配对 t 检验，n = 5，p = 0.004）。（K）在清醒 - NREM 转换中增加的钙信号混合类型转换的 ΔF/F 方差的 Z 分数（对所有合并转换进行 F 检验，p = 3×10^(–7)）。旁边是以热图形式表示的钙信号的十个示例转换。（L）对小鼠之间的 ΔF/F 钙信号方差进行量化（配对 t 检验，n = 5，p = 0.021）。（M）在所有从清醒到 NREM 的转换中，钙信号类型（软增加、急剧增加、混合增加）的每种转换比例。无法分类的钙信号转换标记为 NK。使用 Benjamini-Hochberg 程序以 5% 的错误发现率进行多重比较校正。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。

在向 NREM 睡眠转换时，MnPO/MPO NOS1 神经元的总体钙水平增加，钙信号中的峰值频率也增加。为了量化这些钙信号的变化，我们对多只小鼠的多次清醒 - NREM 转换进行了平均。这些平均值包含几种模式：钙信号的 “软” 上升转换较慢，且峰值更多；以及更快的 “急剧” 模式。从清醒到 NREM 睡眠的软转换如图 1G 所示，以 ΔF/F 绘制，并在 5 分钟的记录内进行平均，同时还有十个示例转换的热图。ΔF/F 钙信号从转换点开始上升，并至少持续 150 秒。这在图 1H 中被量化为曲线下面积。另一方面，MnPO/MPO NOS1 中钙诱导信号的急剧转换则不同，并且预示着下一次 NREM 睡眠转换。这些急剧转换如图 1I 所示为 ΔF/F，旁边是十个示例转换的热图。在这里，ΔF/F 信号在转换开始前最多 60 秒开始上升，并在进入 NREM 睡眠后 30 秒内达到峰值，然后在转换后 1 分钟再次下降。热图显示这些钙事件与清醒 - NREM 转换是时间锁定的。在 100 秒内，尽管处于持续的 NREM 睡眠状态，钙信号几乎恢复到基线水平。这在图 1J 中被量化为基线和最大值之间的平均幅度。钙信号的软转换和急剧转换都具有较慢的时间进程，需要超过 60 秒才能完成。与 MnPO/MPO NOS1 神经元从清醒到 NREM 睡眠转换相关的其余钙信号无法归类为软或急剧模式。然而，当将这些在清醒到 NREM 转换时的剩余钙信号合并并通过方差分析时，可以看到与清醒到 NREM 转换有明显的关联。这些钙信号的 “混合” 转换如图 1K 所示，绘制为 ΔF/F 方差的 Z 分数，旁边是十个示例转换的热图。在这里，在测量的五只动物中的四只中，钙信号的方差在清醒到 NREM 转换期间增加（图 1L）。总体而言，从清醒到 NREM 睡眠时，MnPO/MPO NOS1 的钙信号变化中约 60% 是信号的软增加或急剧增加，30% 是混合增加。大约 10% 的钙信号记录在清醒到 NREM 转换期间未显示活动变化（图 1M）。

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除了 MnPO/MPO NOS1 神经元在从清醒到 NREM 转换时钙信号的增加外，我们还研究了它们在从 NREM 到清醒以及从 NREM 到快速眼动（REM）睡眠转换期间的钙信号（图 2）。我们发现 NREM 睡眠有时会被持续约一分钟的短暂清醒发作（微觉醒）打断。在这些短暂转换中，在进入清醒状态时，MnPO/MPO NOS1 神经元的钙信号会出现小幅下降，并持续下降直到下一次 NREM 发作，然后钙信号再次增加（图 2A、B）。在这种情况下，虽然我们注意到了一些明显的示例，如图 2C 所示，但动物之间也存在很大的差异，并且没有足够的统计效力来推断这些钙信号的小幅下降是否具有显著性（图 2B）。MnPO/MPO NOS1 神经元在从 NREM 到 REM 转换期间的钙信号如图 2D 所示，并旁边是九个示例转换的热图。如前所述，一旦 NREM 开始，钙信号往往会衰减到较低的基线（图 1I）。在从 NREM 到 REM 的转换中，平均 ΔF/F 钙信号在进入 REM 周期至少 30 秒内保持在较低的基线水平（图 2D 中的红色条）。在此之后，信号增加并达到平台期，持续约 60 秒（图 2D、E），并在重新进入 NREM 之前持续到微觉醒发作（见图 2F 中的示例）。

图2. MnPO/MPO 下丘脑的 NOS1 神经元在 REM 周期的后期处于活跃状态。对动物在从熄灯到亮灯的 6 小时光照周期内进行记录，以促进获得睡眠状态的分布。转换情况展示在 180 秒内。（A）当 NREM 被短暂的清醒发作打断时钙信号的平均 ΔF/F。此处的清醒时长为近似值，随后是十个示例转换，以热图形式表示。（B）短暂清醒、前 NREM 和后 NREM 之间的 ΔF/F 钙信号平均变化，针对短暂转换（配对 t 检验，n = 4，前 NREM 与短暂清醒，p = 0.063，后 NREM 与短暂清醒 p = 0.076）。（C）从原始光度数据中 NREM 到清醒转换的示例，按睡眠状态进行颜色编码（NREM，绿色；REM，青色；清醒，蓝色）。（D）从 NREM 到 REM 转换的平均 ΔF/F，显示信号没有明显变化，在大约 30 秒后有较慢的增加，旁边是从 NREM 到 REM 睡眠的九个转换的热图。（E）NREM 周期结束和 REM 周期后期之间的 ΔF/F 钙信号平均变化（配对 t 检验，n = 5，p = 0.066）以及 NREM 和 REM 后之间的变化（配对 t 检验，n = 5，p = 0.034）。（F）NREM 到 REM 到微觉醒到 NREM 转换期间钙信号的示例，按睡眠状态进行颜色编码（NREM，绿色；REM，青色；清醒，蓝色）。**P < 0.01，n.s，不显著。

02.内侧视前区一氧化氮合酶 1 神经元影响睡眠 - 觉醒结构

已经确定 MnPO/MPO 区域的许多 NOS1 神经元在 NREM 和 REM 睡眠期间比在清醒期间更为活跃，接下来我们研究了它们对睡眠结构的贡献。为此，我们使用依赖于 Cre 的破伤风毒素轻链（GFP-TeLC）表达来减少这些细胞的突触传递（图 3A）。破伤风毒素轻链通过切割突触小泡蛋白突触融合蛋白来阻断神经递质小泡的释放（施亚沃等人，1992 年）。将 AAV-FLEX-GFP-TeLC 或 AAV-FLEX-GFP 分别注射到 Nos1-Cre 小鼠的 MnPO/MPO 区域，以产生 Nos1-MnPO/MPO-GFP-TeLC 小鼠和对照 Nos1-MnPO/MPO-GFP 小鼠（图 3B）。减少 NOS1 神经元的突触传递对睡眠结构产生了微小但显著的改变（图 3C）。这些数据针对每只小鼠进行了量化。在光照阶段，平均清醒时间减少了近 25%，相应地 NREM 时间增加了约 10%。随后在熄灯期间 NREM 时间大约减少了 15 - 20%。在 REM 睡眠时间方面没有观察到明显变化。

图3. 减少 MnPO/MPO 下丘脑 NOS1 神经元的神经递质释放以依赖于明暗周期的方式改变睡眠量和睡眠周期的数量。（A）将 AAV-flex-GFP-TeLC 立体定位注射到 Nos1-CRE 小鼠的 MnPO/MPO 区域以产生 Nos1-MnPO/MPO-GFP-TeLC 小鼠的示意图。（B）来自 MnPO/MPO 的示例组织学，显示用 GFP 抗体检测到的 GFP-TeLC 蛋白的表达；左图，低倍放大视图，比例尺为 200 微米，右图，高倍放大视图，比例尺 100 微米。（C）在 12 小时光照或黑暗时间段内对每只小鼠的睡眠状态进行量化，显示为每小时警觉状态的平均时间。光照阶段的清醒时间（双尾 t 检验，n = 7 和 n = 10，p = 0.003），光照阶段的 NREM 时间（双尾 t 检验，n = 7 和 n = 10，p = 0.0006），黑暗阶段的 NREM 时间（双尾 t 检验，n = 7 和 n = 10，p = 0.018）。（D）光照和黑暗之间清醒、NREM 和 REM 的周期数量。黑暗阶段的 REM（双尾 t 检验，n = 7 和 n = 10，p = 0.003）。（E）对光照阶段睡眠状态之间的睡眠转换进行分析。两组之间未观察到差异。（F）Nos1-MnPO/MPO-GFP-TeLC 小鼠和 Nos1-MnPO/MPO-GFP 小鼠在黑暗阶段的转换情况。从 NREM 到 REM 的转换（p = 0.025）和从 REM 到清醒的转换（p = 0.031），来自双尾 t 检验，n = 7 和 n = 10。使用 Benjamini-Hochberg 程序以 5% 的错误发现率进行多重比较校正。*P < 0.05，**P < 0.01，N.S，不显著。

我们评估了在 Nos1-MnPO/MPO-GFP-TeLC 小鼠中观察到的睡眠结构变化是否影响睡眠周期动态和 / 或转换（图 3D）。在周期的光照或黑暗阶段，清醒或 NREM 睡眠的总周期数量没有变化；然而，在黑暗阶段 REM 周期数量大约减少了 45%（图 3D）。与此结果一致的是，NREM-REM 和 REM - 清醒的转换数量，但不是清醒和 NREM 睡眠之间的转换数量，大约减少了 40%。在光照阶段没有观察到变化（图 3E、F）。尽管这在 REM 睡眠时间上没有体现，但与黑暗阶段 NREM 时间减少是一致的。此外，我们预期剩余的 REM 睡眠会因此更加集中。

因为我们在光照或黑暗阶段没有观察到清醒或 NREM 周期数量的总体变化，所以我们研究了周期长度和警觉状态数量，以查看这是否能解释在睡眠时间上看到的差异（图 4）。在 Nos1-MnPO/MPO-GFP-TeLC 小鼠中，我们观察到在光照阶段最长清醒周期（>20 分钟）的频率大约减少了 50%（图 4A），尽管在 NREM 和 REM 睡眠的周期长度和数量方面没有看到变化（图 4B、C）。在黑暗阶段，清醒的平均值没有变化，并且数据的方差更大（图 4D）。然而，虽然与光照阶段相比，Nos1-MnPO/MPO-GFP 对照小鼠在黑暗阶段大于 20 分钟的周期频率降低，但 Nos1-MnPO/MPO-GFP-TeLC 小鼠这些周期的频率反而增加了。通过计算每只小鼠在光照和黑暗阶段之间的配对差异，很明显 Nos1-MnPO/MPO-GFP-TeLC 小鼠受光照变化的影响更大（图 4D，插图）。在熄灯期间，NREM 和 REM 睡眠的周期长度和数量没有进一步的变化（图 4E、F）。

图4. Nos1-MnPO/MPO-GFP-TeLC 小鼠在光照期间清醒时睡眠周期长度的分布减少，但在黑暗期间清醒时增加。（A）按周期长度划分的光照期间清醒时间。在小于 20 分钟的区间内没有观察到差异。Nos1-MnPO/MPO-GFP-TeLC 小鼠中大于 20 分钟的周期（n = 7 TeLC 和 n = 10 GFP，p = 0.02）。（B）按周期长度划分的光照期间 NREM 时间。在小于 10 分钟的区间内没有观察到差异（n = 7 TeLC 和 n = 10 GFP）。（C）光照阶段 REM 时间。在小于 4 分钟的区间内没有观察到差异（n = 7 TeLC 和 n = 10 GFP）。（D）黑暗阶段清醒时间。在每个光照周期内两组之间没有观察到差异（n = 7 TeLC 和 n = 10 GFP）。插图，光照期间 Nos1-MnPO/MPO-GFP 和 Nos1-MnPO/MPO-GFP-TeLC 组之间的配对差异（d，插图，n = 7 TeLC 和 n = 10 GFP，p = 0.036）。（E）黑暗阶段 NREM 时间。在小于 10 分钟的区间内没有观察到差异（n = 7 TeLC 和 n = 10 GFP）。（F）黑暗阶段 REM 时间。在大于 1 分钟的区间内没有。

03.内侧视前区一氧化氮合酶 1 神经元在快速眼动睡眠期间影响 θ 波功率

我们将 Nos1-MnPO/MPO-GFP-TeLC 小鼠与 Nos1-MnPO/MPO-GFP 对照小鼠的睡眠状态特定功率谱，在对每只小鼠内的清醒功率进行归一化后进行了分析。在光照阶段，非快速眼动（NREM）睡眠与功率变化无关（图 5A、B）；然而，快速眼动（REM）睡眠确实出现了显著变化（图 5C）。具体而言，通常与 NREM 睡眠相关的 δ 波功率增加了约 30%，同时 θ 波功率相应降低（图 5D）。这种差异出现在 δ 波功率的 2 - 4 赫兹范围内，即所谓的 δ2 频段（哈伯德等人，2020 年）。θ 波（6 - 9 赫兹）功率降低了约 20%，但在更高频率（10 - 14 赫兹）下未观察到变化。在黑暗阶段（图 5E、F），NREM 睡眠的 θ 波功率降低了约 15%。这与光照阶段该频段无变化形成对比。对于黑暗阶段的 REM 睡眠（图 5G、H），Nos1-MnPO/MPO-GFP-TeLC 小鼠和 Nos1-MnPO/MPO-GFP 小鼠之间的差异与光照阶段相似，δ2 功率增加约 25%，θ 波功率降低 20%。

图5. MnPO/MPO 中的 NOS1 神经元在 REM 睡眠期间影响 θ 波功率。（A）光照期间 NREM 的归一化功率，以功率谱形式显示。还展示了不同的频段。（B）对于光照期间的 NREM，显示了相关频段内每只小鼠的数据。（C）光照期间的 REM。（D）对光照期间 REM 的光谱差异进行量化，显示在 TeLC 条件下 δ2 频段功率更高（t 检验，n = 6，TeLC；n = 10，GFP；p = 0.015），同时 θ 波功率降低（t 检验，n = 6，TeLC；n = 10，GFP；p = 0.017）。（E）黑暗期间 NREM 的归一化功率，以功率谱形式显示。（F）显示了相关频段内每只小鼠的数据（t 检验，n = 6，TeLC；n = 10，GFP；p = 0.048）。（G）黑暗期间的 REM。（H）对光照期间 REM 的光谱差异进行量化（组间 δ2 频段，t 检验，n = 6，TeLC；n = 10，GFP；p = 0.017）。组间 θ 波（t 检验，n = 6，TeLC；n = 10，GFP；p = 0.013）。使用 Benjamini-Hochberg 程序以 5% 的错误发现率进行多重比较校正。*P < 0.05，n.s，不显著。

04.内侧视前区一氧化氮合酶 1 神经元降低体温

我们使用植入的温度记录仪，以 2 分钟的分辨率测量了 Nos1-MnPO/MPO-GFP-TeLC 小鼠和 Nos1-MnPO/MPO-GFP 小鼠的核心体温（图 6）。我们通过首先对每只小鼠 7 天的数据（5040 次测量）进行平均，然后比较各组的分布情况，得出了一个典型的 24 小时体温变化周期。与对照小鼠相比，Nos1-MnPO/MPO-GFP-TeLC 小鼠的体温分布向更高温度偏移（图 6A）。累积分布表明，最显著的变化出现在观察到核心体温在 35.5 至 36°C 之间的概率上，但最低和最高体温没有变化（图 6B）。此外，在黑暗阶段，Nos1-MnPO/MPO-GFP 对照小鼠的核心体温会下降，而 Nos1-MnPO/MPO-GFP-TeLC 小鼠在黑暗阶段中期以及下一次亮灯前均未出现体温下降（图 6C、D）；而且，在午睡期间（ZT16 - 20），与对照小鼠相比，Nos1-MnPO/MPO-GFP-TeLC 小鼠的 NREM 睡眠时间总共减少了 36%，尽管 NREM 睡眠周期数量或平均长度没有显著变化（图 6E）。

图6. MnPO/MPO 下丘脑的 NOS1 神经元起到降低体温的作用。（A）对每只小鼠 7 天的记录数据进行汇总，按 ZT 时间以 2 分钟为间隔进行平均，生成 “典型” 的日直方图，并对每组数据进行平均（重复测量方差分析，n = 4，TeLC；n = 6，GFP；在 35.4 - 35.6°C 时，温度 × 组，p = 1.97×10^(–4)）。（B）体温分布的累积频率。（C）24 小时体温曲线。（D）对光照和黑暗阶段 24 小时体温曲线进行量化（假设方差不等的双尾 t 检验，n = 4，TeLC；n = 3，GFP；p = 0.041）。（E）在 ZT16 - 20 的 “午睡” 期间的睡眠百分比、周期数量和周期长度（双尾 t 检验，n = 7 和 n = 10，p = 0.01）。*P < 0.05，N.S，不显著。

四、讨论

在这项研究中，我们发现视前区下丘脑中线的许多一氧化氮合酶 1（NOS1）细胞在自然状态下于睡眠时处于活跃状态，尽管似乎存在几种不同的反应类型，并且可能存在几种不同类型的细胞。根据它们的钙信号，这些 NOS1 细胞从清醒到非快速眼动（NREM）睡眠时快速且短暂的 “急剧” 激活，以及从清醒到 NREM 睡眠时较为缓慢、持续的 “软” 转换，可能代表了两种在睡眠时活跃的 NOS1 神经元群体。然而，这些细胞并非在整个 NREM 睡眠期间都处于活跃状态，而是在从清醒到 NREM 的转换阶段以及随后 NREM 睡眠的最初阶段最为活跃。它们在快速眼动（REM）睡眠的后期阶段也会变得活跃。“急剧转换” 的亚群更有可能在睡眠起始中发挥作用，而其他群体的活动似乎是在 NREM 和 REM 睡眠状态确立之后才出现。这些细胞在清醒期间并非完全不活动，而是间歇性地活跃。少数（10%）的这些 NOS1 细胞在警觉状态转换时其钙信号没有变化，这再次表明存在细胞亚型。我们在 NOS1 神经元中表达破伤风毒素轻链（TeLC）来破坏它们的突触活动，这反过来又以一种随 24 小时周期的光照或黑暗阶段而变化的方式，扰乱了小鼠的睡眠 - 觉醒状态。在黑暗阶段，在 MnPO/MPO NOS1 神经元中表达 TeLC 的小鼠表现出 NREM 睡眠时间减少，并且最短的 REM 睡眠周期消失；从 NREM 到 REM 以及从 REM 到清醒的转换也减少了。REM 睡眠伴随着 δ 波功率增加和 θ 波功率降低，这可能表明 REM 睡眠的功能受到了干扰。然而，在光照阶段，NREM 睡眠时间增加了，但 REM 睡眠没有变化。总体而言，这些小鼠的体温长期处于较高水平。

我们的新结果与我们之前对这些细胞的研究一致。之前研究人员已经表明，当小鼠受到外部温暖刺激后对 MnPO/MPO 区域的一部分谷氨酸 / NOS1 神经元进行活动标记，在重新激活时，这些神经元能够诱导 NREM 睡眠并伴随身体降温。同样，以相同方式标记的 MnPO/MPO 区域的 γ- 氨基丁酸能（GABAergic）神经元群体，只能诱导睡眠。由于通过免疫组织化学研究人员没有观察到这些群体之间的重叠，研究人员提出了一个外部温暖触发睡眠的模型，即 MnPO/MPO 区域的 NOS1 / 谷氨酸神经元群体向下游 MPO 区域的 GABA 能神经元群体发送信号。因此，MnPO/MPO NOS1 神经元能够感知温度变化，尽管研究人员不知道这是直接感知还是通过来自皮肤的传入神经。在 Nos1-MnPO/MPO-GFP-TeLC 小鼠中，与预期的 NREM 睡眠在光照阶段保持不变或减少相反，这些小鼠在光照阶段的 NREM 睡眠时间增加，随后在黑暗阶段该状态的时间减少。所以，这些睡眠 - 觉醒状态的变化可能是由改变的体温调节引起的，或者由于可能存在多种细胞亚型，这种影响较为复杂。对 REM 睡眠的影响（在黑暗阶段具有选择性）是出乎意料的，但考虑到 REM 睡眠部分由 MPO 区域未知的细胞类型控制，这也许并不奇怪，并且我们大概影响了参与 REM 睡眠产生的一种 NOS1 细胞亚型。或者，当 NOS1 神经元被阻断时 REM 睡眠的减少可能与 NREM 睡眠的减少有关，这两者都发生在黑暗阶段，而不是 REM 特异性机制的结果。这一观点与 REM 睡眠期间较低的 θ 波功率一致，这可能表明 REM 睡眠倾向降低。

最初，鉴于通过原位杂交和免疫组织化学检测发现，MPO 下丘脑区域的 nos1 基因表达具有高度受限的表达模式，我们预计 nos1 基因表达将是对独特细胞亚群进行功能操纵的一个实用且有用的标记。不幸的是，事实并非如此。虽然通过钙光度法研究的 MPO 区域的许多 NOS1 神经元具有明显的睡眠活跃模式，但自从我们开始这项工作以来，很明显视前区（PO）存在多种 NOS1 神经元亚型，包括 NOS1 / 囊泡型谷氨酸转运体 2（VGLUT2）、NOS1 / 囊泡型 GABA 转运体（VGAT）、NOS1 / 甘丙肽神经元等。当在 MnPO/MPO NOS1 神经元中表达 TeLC 时，睡眠的双向变化可能反映了 MnPO/MPO 区域中多种 NOS1 细胞亚型的突触神经递质释放减少。例如，PO 区域谷氨酸（VGLUT2）神经元的激活会诱导清醒状态，所以如果这个特定的亚群表达 nos1 基因，在它们中表达 TeLC 可能会减少清醒时间；另一方面，研究人员之前已经表明，表达 nos1 的 GABA 细胞会诱导 NREM 睡眠；因此，在 NOS1 细胞中表达 TeLC 可能会促进清醒状态。进一步剖析这一神经回路需要采用交叉遗传学方法。尽管如此，仍然引人注目的是，大多数 MnPO/MPO NOS1 细胞的大部分活动发生在从清醒到 NREM 睡眠的转换阶段，以及 REM 睡眠周期的后期。NOS1 神经元的作用靶点可能包括外侧视前区（LPO）的 GABA 能和甘丙肽能神经元，这些神经元参与 NREM 睡眠的诱导和维持，以及尚未被表征的长程靶点。虽然我们一直使用相同的坐标，但我们没有尝试区分 MnPO 和 MPO 这两个相邻小区域中的 NOS1 细胞。

在 MnPO/MPO NOS1 神经元中表达 TeLC 会使小鼠的平均体温升高。这与 MPO 区域中表达脑源性神经营养因子（BDNF）/ 垂体腺苷酸环化酶激活多肽（PACAP）或瞬时受体电位 M2（TRPM2）的神经元对体温的调节作用一致；这些神经元可能会共表达 NOS1。PO 区域中也存在促进清醒的谷氨酸能神经元，它们与大约 1°C 的轻微身体降温有关，也可能发挥作用，并且可能也表达 nos1 基因。然而，与 BDNF/PACAP 或 TRPM2 细胞对体温的影响不同，我们观察到的体温升高似乎与明暗周期的光照阶段相关，具体是在午睡时间（ZT16-20）以及从黑暗到光照转换之前的时间段。因此，MnPO/MPO NOS1 细胞在诱导 NREM 睡眠的同时降低体温，这与我们早期的研究一致。总体而言，这可能支持一个关于优化睡眠以实现能量重新分配的更大假设。

总之，我们发现一些 MnPO/MPO NOS1 细胞的活动模式相当显著，在从清醒到 NREM 的转换阶段以及 REM 睡眠后期具有相当的选择性，并且 PO 区域 NOS1 神经元的突触传递可能有助于 NREM 和 REM 睡眠的组织，以及长期的身体降温。我们使用 “可能” 这个词，是因为我们尚未正式证明 TeLC 的表达会减少这些神经元中的神经递质释放，并且我们尚未确定 MnPO/MPO NOS1 细胞的突触后靶点。目前我们认为，MnPO/MPO NOS1 神经元可能既有短距离的局部输出，也有可以释放神经递质的长程连接。另一个需要注意的是，一氧化氮（NO）本身很可能是这些细胞信号系统的一部分。我们没有研究这个问题，因为细胞释放 NO 独立于囊泡释放。但是，由于 NOS1 合酶是钙依赖性的，在从清醒到 NREM 的转换阶段以及 NREM 睡眠期间，NOS1 神经元中升高的钙水平将导致这些细胞释放 NO，并且 NO 很可能会影响睡眠结构和体温调节。我们进一步推测，NOS1 神经元可能通过释放 NO，在睡眠的背景下对控制血管舒张发挥作用。我们应该记住，我们只研究了雄性小鼠，并且由于 PO 区域存在性别二态性，NOS 神经元的作用在不同性别之间可能会有所不同。鉴于一些 MnPO/MPO NOS1 细胞在从清醒到 NREM 的转换阶段具有相当精确的钙活动，进一步的剖析可能会揭示控制睡眠诱导 / 维持以及同时降低体温的调节回路的一部分。

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