对高架十字迷宫（EPM）中极端行为进行选择性育种，产生了两个小鼠品系，即高焦虑行为（HAB）小鼠和低焦虑行为（LAB）小鼠。通过新颖的行为测试，我们证实HAB小鼠还会表现出适应不良的逃避行为和防御性发声，而LAB小鼠在逃避逼近的威胁时存在严重缺陷，这部分归因于感觉缺陷。我们借助活体锰增强磁共振成像（MEMRI），后续辅以药理学或化学遗传学干预，发现这些行为畸变与HAB小鼠中脑导水管周围灰质（PAG）以及LAB小鼠上丘（SC）的大脑活动紧张性变化有关。因此，中脑顶盖结构控制着焦虑样行为和防御反应的表达。我们的研究结果对在描述小鼠行为时不加思考地使用 “焦虑” 或 “焦虑样” 这类拟人化术语提出了质疑，因为这些术语暗示存在更高层次的认知过程，而小鼠不一定具备这些过程。

二、引言

“焦虑” 或 “焦虑样” 这类拟人化术语，被广泛用于描述实验动物的情感状态。焦虑的定义（美国精神病学协会）包括对遥远或潜在威胁的担忧，而过度焦虑与对虚幻威胁的持续反复思考相结合，则表明存在焦虑症。另一方面，恐惧描述的是针对明确的威胁性刺激所引发的情感状态（“感到害怕”）。

恐惧的行为模式，即防御反应的总和，源于防御生存回路的激活。其功能要么是增大个体与威胁之间的距离（逃跑），使个体对威胁不可见（僵住），要么最终使个体能够进行对抗。这包括自主神经和神经内分泌过程，这些过程让生物体为成功逃跑做好准备，例如，通过心率和呼吸频率增加，以及通过下丘脑 - 垂体 - 肾上腺 - 髓质（HPA）轴活动增强来释放应激激素得以体现。如先前所指出的，这种状态最宜被描述为防御性机体状态。因此，可以说感到焦虑或害怕的主观感受是认知过程，而焦虑、恐惧和恐慌的行为表现则是生理或身体过程，这些过程通常由皮质下和中脑结构协调。在实验动物，如小鼠和大鼠中，我们无法触及这些主观的内在认知状态，而只能完全依赖于对生理和行为数据的解读。

因此，多种行为测试范式旨在根据对特定刺激或情境所引发的防御行为的类型和性质，来评估焦虑、恐惧或恐慌状态。在此过程中，诸如在高架十字迷宫（EPM）中避开暴露且光照充足区域的较为微妙的行为，会被解读为焦虑。相比之下，听到先前经过负性条件化的声音（听觉/巴甫洛夫恐惧条件反射；相关综述见后，突然跳跃（一种与惊吓反应完全不同的逃跑反应），随后出现明显的静止不动（僵住），这种行为通常与恐惧相关。这些测试表明，焦虑和恐惧的行为测量方式存在明显差异。例如，听觉恐惧条件反射实验为深入理解杏仁核回路在表达单一特征防御反应（即僵住）中的作用铺平了道路。然而，在更复杂且与动物行为学相关的测试情境中，人们可以观察到，随着威胁的迫近程度（即防御距离）以及逃跑能力的变化，动物会逐渐从风险评估过渡到回避、逃跑或强直性静止，最终发展为类似战斗/恐慌的跳跃行为。这种关系最初被概念化为捕食迫近连续体），后来被整合到二维防御系统中。二维防御系统具有特别重要的意义，因为它全面描述了防御性回避和防御性趋近与防御距离（感知到的与威胁的距离）之间的相互作用。此外，它突出了在协调焦虑、恐惧和恐慌的行为表达过程中，主要脑结构的功能层级。在这种背景下，科学家重新评估了中脑导水管周围灰质（PAG） “在焦虑控制的最低层级” 的功能。

基于这一思路，我们感兴趣的是：一方面，一个针对特质焦虑极端情况的小鼠模型的行为表型在多大程度上伴随着防御反应水平的改变；另一方面，这种表型能否由中脑结构中神经元活动的变化来解释 。作为模式生物，我们选择了两个小鼠品系，它们由CD1小鼠经选择性育种而来，育种依据是小鼠在高架十字迷宫（EPM）——一种经典焦虑测试中的行为。由此培育出了高焦虑行为（HAB）的极度焦虑小鼠和低焦虑行为（LAB）的低焦虑小鼠，并将它们与正常焦虑行为（NAB）的小鼠进行比较。除了之前提到的在高架十字迷宫中的焦虑样表型，这些品系在其他行为学和生理学指标上也表现出显著差异（见表1）。在HAB小鼠中，大多数行为指标倾向于静止不动或缺乏探索驱动力。这存在错误解读的风险，因为运动活动和/或动机的改变也可能解释这种极端表型。在本研究中，我们全面地对HAB、NAB和LAB（HNL）小鼠在高架十字迷宫中的极端行为表型进行了重新表征。我们提供的证据表明，在HAB动物中，只有基于行为学的高架十字迷宫测量指标和自主神经唤醒水平对抗焦虑治疗敏感。此外，我们首次证明成年HAB动物有发出可听声鸣叫的倾向，而抗焦虑药物地西泮会减少这种鸣叫。进一步地，我们利用两个新颖的多感官任务（Robocat和Indy迷宫）表明，HAB和LAB动物的高或低焦虑样行为的极端情况，伴随着防御反应的相应改变，这两个任务用于检测对接近的威胁性刺激的重复的、先天的逃避行为。由此，我们证明HAB动物表现出适应不良的防御反应水平改变，而LAB动物对威胁性刺激表现出严重的反应缺陷。我们采用多种互补策略来探测HNL动物的视觉能力（视动反应、视网膜电图等），结果表明LAB动物存在完全的视网膜失明。为了评估HAB和LAB动物体内的紧张性/基础全脑神经元活动变化，我们采用了锰增强磁共振成像（MEMRI）。据此，我们提供的证据表明，HAB小鼠中脑导水管周围灰质（PAG）内的神经元活动增加，而LAB小鼠上丘（SC）深层的活动减少。最后，通过在LAB小鼠中采用 “仅由设计药物激活的设计受体”（DREADD）方法，或者对HAB小鼠进行蝇蕈醇局部注射，我们能够部分逆转LAB和HAB动物在焦虑样行为中的极端表型。

ASR：听觉惊跳反应；CS：条件刺激；CORT：皮质酮；CPP：条件性位置偏爱；CRH：促肾上腺皮质激素释放激素；DEX：地塞米松抑制/CRH刺激试验；DLB：明暗箱；EPM：高架十字迷宫；FC：听觉/情境恐惧条件反射；FST：强迫游泳试验；HB：洞板试验；HR：心率；HRV：心率变异性；IA：抑制性回避；IHC：免疫组织化学；OBS：由经验丰富的实验者进行观察或视觉评分；OF：旷场实验；SP：蔗糖偏好试验；TMT：2,5 - 二氢 - 2,4,5 - 三甲基噻唑啉；TM：遥测；USV：超声发声；VSDI：电压敏感染料成像；WCM：水迷宫。—— 大幅下降；- 轻微下降；无变化；+ 轻微上升；++ 大幅上升；n.a. 不适用。注意：仅考虑那些直接将HAB与NAB、LAB与NAB进行比较的参考文献。结果HAB、NAB、LAB 小鼠在高架十字迷宫中的行为评估

三、结果

HAB、NAB、LAB 小鼠在高架十字迷宫中的行为评估

架十字迷宫（EPM）被认为是检测小鼠焦虑样行为改变的可靠实验。然而，标准测试时长通常不超过 5 - 10 分钟，由于严格的截止标准，个体间在回避行为上的显著差异，尤其是其在药物调节方面的差异被掩盖了。为解决这一问题，我们将测试时长延长至 30 分钟，并重新评估了 HAB（N = 11）、NAB（N = 7）和 LAB（N = 7）小鼠在高架十字迷宫中的行为。除潜伏期（0 - 30 分钟）和伸展注意姿势（0 - 15 分钟）外，我们聚焦于前 5 分钟的所有参数，以便得出与以往研究具有较大可比性的测量结果（见图 1A）。对整个观察期获得的数据进行分析后发现，结果基本相同（未展示）。

通过这种方式，我们发现小鼠在探索开放臂的潜伏期上存在显著的组间差异（F(2, 22) = 15.07，p < 0.0001）（见图1A）。超过45%的HAB小鼠即便在延长至30分钟的测试时间内，也未进入开放臂，而NAB小鼠的这一比例为0%（卡方检验，χ² = 4.41，p = 0.0358）。相反，所有LAB小鼠都在6分钟内进入了开放臂。这些明显的行为特征也体现在小鼠在开放臂上停留的时间百分比上：LAB小鼠为53.6 ± 11.3%，而NAB小鼠为2.4 ± 0.8%（F(2, 22) = 26.25，p < 0.0001）。此外，LAB小鼠的总体运动活动增加（移动距离为1400.0 ± 171.7厘米，而NAB小鼠为723.0 ± 60.8厘米，F(2, 22) = 22.49，p < 0.0001）。相反，HAB小鼠超过85%的时间都待在封闭臂（F(2, 22) = 28.98，p < 0.0001），并且它们也避免停留在中央区域（停留时间占比为13.0 ± 2.3%，而NAB小鼠为33.8 ± 4.0%，F(2, 22) = 12.96，p = 0.002）。这些观察结果与之前关于HAB、NAB和LAB小鼠在高架十字迷宫中行为的报道一致。NAB小鼠在开放臂停留时间相当短，这可能与特定的测试条件有关（我们将高架十字迷宫放置在一个宽敞、光线昏暗且没有额外围挡的房间中央 ）。为补充传统的高架十字迷宫参数，我们对伸展注意姿势（SAP）的表现进行了分析，将其作为一种行为学测量指标（图1B）。伸展注意姿势是一种主动风险评估行为。先前研究表明，抗焦虑治疗会使SAP的数量减少），而致焦虑的5 - HT2C/1B受体拮抗剂mCPP会使其增加。此外，SAP的表现取决于是否存在迫在眉睫的威胁或潜在的威胁情境，它能体现动物探索潜在威胁环境的总体动机。LAB小鼠（N = 6，有一只小鼠因未表现出SAP而被排除）表现出的SAP数量显著较少（图1B；F(2, 19) = 29.84，p < 0.0001；LAB小鼠为20.7 ± 5.9次，NAB小鼠为63.0 ± 4.3次），而HAB小鼠与NAB小鼠在这方面无明显差异（图1B；N = 5，两只小鼠因未表现出SAP而被排除）。从SAP的总持续时间来看，HAB小鼠的持续时间更长（HAB小鼠为222.4 ± 16.8秒，NAB小鼠为158.0 ± 15.2秒），而LAB小鼠平均仅花费33.7 ± 12.3秒表现SAP（F(2, 19) = 32.74，p < 0.0001）。如果以5分钟为间隔进行分析，NAB小鼠能够适应高架十字迷宫，其SAP持续时间逐渐减少。相反，HAB小鼠在15分钟后表现出升高且不衰减的反应（组间与时间的交互作用：F(2, 28) = 3.587，p = 0.0410；双向重复测量方差分析），并且自主神经唤醒程度更高，这在高架十字迷宫测试任务期间小鼠排便显著增多上得以体现（图1C；HAB小鼠为11.6 ± 1.2次，NAB小鼠为7.7 ± 0.7次，F(2, 21) = 4.779，p = 0.0195）。

在将小鼠放置到高架十字迷宫（EPM）之前，通过将每只小鼠从网格笼顶提起3次，测试它们发出可听声鸣叫的倾向。至少鸣叫一次的小鼠被计为 “鸣叫者”。结果显示，NAB组（N = 13）和LAB组（N = 15）的小鼠均未发出任何一次鸣叫，而HAB组（N = 15）中有47% 的小鼠至少鸣叫了一次（图1D；卡方检验，χ² = 15.61，p = 0.0004）。为了探究HAB小鼠的表型在多大程度上能被传统抗焦虑药物调节，我们对两组未经实验的HAB小鼠（每组N = 13）分别注射地西泮（DZP，1mg/kg，腹腔注射）或溶媒（生理盐水）。除了运动活性有所增加外（图1E；t检验，t₂₄ = 2.174，p = 0.0398），经典的EPM参数对DZP处理均不敏感。DZP处理后，伸展注意姿势（SAP）的总数和总持续时间均未发生显著改变（图1F）。然而，以5分钟为间隔进行分析时发现，DZP使经溶媒处理的HAB小鼠原本不衰减的SAP表现转变为衰减趋势（处理与时间的交互作用：F(2, 28) = 3.587，p = 0.0410；双向重复测量方差分析），这与NAB小鼠的情况类似。此外，DZP处理减少了排便次数（图1G；1.5 ± 0.5次 vs. 5.8 ± 1.2次，t检验，t₂₄ = 3.344，p = 0.0027），并且降低了在5分钟悬尾实验（TST）中的鸣叫倾向（图1H；13只中有3只鸣叫 vs. 13只中有9只鸣叫，双侧Fisher精确检验，p = 0.0472）。与图1D中的数据相比，鸣叫者的绝对发生率更高，这很可能是由于先前注射带来的应激所致。反过来，排便分数绝对值较低，部分原因可能是在注射过程中已经排便。综上所述，HAB、NAB和LAB小鼠在EPM实验中表现出稳定的行为表型。此外，在我们的实验条件下，传统的EPM测量指标对地西泮处理不敏感，而诸如自主神经唤醒、鸣叫和主动风险评估等更符合动物行为学的测量指标则较为敏感。

01、两种基于动物行为学设计的新测试情境揭示了 HAB 和 LAB 小鼠先天防御反应的极端情况

在高架十字迷宫（EPM）上获得的行为测量结果表明，这是一种接近 - 回避情境，在 HAB 和 LAB 小鼠中表现各异。将 EPM 称为 “焦虑测试”，意味着存在一种内在冲突，这会误导性地指向诸如由前额叶区域介导的更高认知过程。单独观察回避行为时，很明显存在强大的皮质下成分，它与逃跑和恐慌样反应处于连续统一体中，很可能涉及杏仁核、腹内侧下丘脑、中脑导水管周围灰质和上丘。因此，我们想知道 HAB 和 LAB 小鼠在 EPM 上改变的表型是否伴随着防御反应的变化，就像之前有研究表明条件性恐惧存在这种情况一样。为了规避学习介导的影响，我们聚焦于小鼠在与（潜在）威胁急性对峙时的先天防御反应。

评估一般先天性恐惧水平的实验范式应纳入多感官刺激，并允许重复测试以及限时接触。由于缺乏合适的测试情境，我们开发了两种新的实验范式：“机器猫”（Robocat，见相关内容），它基于科学家在2010年发表的设计；以及“印第安纳迷宫”（Indy Maze），其灵感来源于一部热门电影。（关于这两种测试的详细描述，见“方法与材料”部分）。图2A展示了“机器猫”任务中获得的不同行为读数。小鼠可能会触发“机器猫”并随后表现出逃跑反应，也可能触发“机器猫”但只是绕过它，或者触发“机器猫”并与之碰撞。我们使用“机器猫”任务评估了HAB（N = 7）、NAB（N = 6）和LAB（N = 9）小鼠的先天性防御反应。图2B描绘了在10分钟接触“机器猫”的过程中，至少表现出一次相应行为的动物百分比。在这次试验中，动物多次触发“机器猫”（HAB组为2.4 ± 0.4次，NAB组为3.5 ± 0.6次，LAB组为10.8 ± 2.1次）。HAB小鼠无法适应“机器猫”的启动，在所有接触中都表现出逃跑反应（Fisher精确检验，p = 0.021），它们从不绕过“机器猫”（Fisher精确检验，p = 0.0047），也不与之碰撞。

图1. HAB、NAB、LAB小鼠在高架十字迷宫（EPM）上的行为评估(A) 使用标准的高架十字迷宫，但将截止时间延长至30分钟，对HAB（N = 11）、NAB（N = 7）和LAB（N = 7）小鼠评估以下行为参数：进入开放臂的潜伏期、开放臂停留时间（前5分钟；0 - 5分钟）、中央区域停留时间（0 - 5分钟）、封闭臂停留时间（0 - 5分钟）以及小鼠移动的距离（0 - 5分钟）。(B) 除了经典的EPM参数，我们还研究了伸展注意姿势（SAP）的表现，以此作为主动风险评估的指标：任务前15分钟内SAP的总数、前15分钟内SAP的总持续时间，以及以5分钟为间隔的SAP持续时间。(C) 在EPM测试期间的排便情况（粪便颗粒数量），作为自主神经唤醒的间接指标。(D) 发出可听声鸣叫的倾向。(E) 一组未经实验的HAB小鼠在暴露于EPM之前，分别接受地西泮（1mg/kg，腹腔注射；N = 13）或溶媒（生理盐水，N = 13）处理。(F) 接受地西泮/溶媒处理的HAB小鼠在EPM测试期间伸展注意姿势的表现。(G) HAB小鼠的排便情况。(H) 为了以标准化方式评估鸣叫倾向，对接受地西泮/溶媒处理的HAB小鼠进行5分钟悬尾实验，同时记录音频信号并进行离线评分。星号表示通过t检验（t）或单因素方差分析（1 - way ANOVA）后，再进行Newman - Keuls多重比较/Bonferroni事后检验（bf）得到的显著性值，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001；美元符号表示通过卡方检验（χ²）得到的显著性值，$ p < 0.05，$$$ p < 0.001；井号表示通过双因素方差分析（2 - way ANOVA）得到的组间效应，## p < 0.01。数值以平均值 ± 标准误表示。相反，NAB小鼠表现出均衡的行为模式：只有少数小鼠（33%）会逃离机器猫，或者被机器猫撞到（17%），而83% 的NAB小鼠至少有一次容忍并绕过了这个威胁性刺激。LAB小鼠的行为则截然不同：没有一只LAB小鼠在机器猫移动时逃离，而是全部选择绕过。然而，最引人注目的是，绝大多数LAB小鼠（89%）甚至至少有一次与机器猫发生碰撞（Fisher精确检验，p = 0.011）。

机器猫任务揭示了HAB和NAB小鼠之间不同的防御反应，HAB小鼠无法绕过机器猫的行为可被视为适应不良行为。与此同时，由于机器猫任务具有较高的可控性（小鼠可以选择绕过机器猫或从该区域撤离以避免激活/对抗），难以判断NAB和LAB小鼠是否表现出不同程度的防御反应：无法表达防御反应和高度适应这两种情况，都会导致可观察到的防御反应水平降低。为避免这一混淆变量，我们开发了印第安纳迷宫测试。在该测试中，小鼠在一个坡度小于1°的狭窄隧道中，面对一个以25cm/s速度滚动的100g聚苯乙烯泡沫球。因此，每次测试小鼠都要与威胁性刺激直接接触。测试操作流程如图2C所示。首先，小鼠可自由进入测试区域，记录其首次离开的潜伏期，该指标与其他应急任务的类似指标具有可比性（图2D），相当于高架十字迷宫测试中的离开潜伏期。HAB小鼠离开起始隔间的潜伏期较长（HAB：977.4 ± 79.2s，NAB：392.1 ± 66.1s），而LAB小鼠与NAB小鼠无显著差异（F₂,₅₀ = 12.64，p < 0.0001）。相当数量的HAB小鼠在30分钟内都未离开起始隔间（卡方检验，χ²₂,₆₂ = 6.671，p = 0.0356）（图2E）。一旦小鼠离开起始隔间，它们探索整个测试区域的潜伏期同样较低（HAB：68.8 ± 10.1s；NAB：213.1 ± 72.8s；LAB：100.4 ± 18.2s）（图2F）。这表明三个品系的小鼠具有相当的探索驱动力，排除了首次离开潜伏期增加仅仅是由于缺乏动机或运动行为受损的可能性。观察防御反应（图2G），包括在球撞击前的抢先逃跑反应或被球撞击后的躲避反应，很明显HAB和NAB小鼠都能对接近的威胁性刺激做出适当反应，而60%的LAB小鼠表现出明显的缺陷，至少未能产生一次防御反应（卡方检验，χ²₁,₂₇ = 13.11，p = 0.0014）。为测试印第安纳迷宫测试获得的行为指标是否可被抗焦虑药物调节，另一组HAB小鼠分别接受地西泮（DZP，1mg/kg，N = 13）或溶媒（VHC，生理盐水，N = 12）处理后，进行印第安纳迷宫测试。地西泮处理可显著降低首次离开的潜伏期（图2H；VHC组：1011.0 ± 153.4s，DZP组：595.5 ± 133.5s；曼 - 惠特尼双尾检验，U₁ = 208，n₂ = 117，U = 39.00，p < 0.0363），表明具有抗焦虑效果，而对探索结束潜伏期无影响。然而，地西泮处理对调节防御反应无效（防御反应率：VHC组100%，DZP组100%）。NAB和HAB小鼠，但不是LAB小鼠，在再次进入测试区域中部时潜伏期增加，表明它们对与球的再次接触有短期回避行为。一周后，与首次测试相比，HAB和NAB小鼠首次进入的潜伏期显著降低。尽管如此，只有NAB小鼠对测试区域中部表现出长期回避行为，这表明高度恐惧/焦虑对回避行为的发展产生了适应不良的后果（数据未展示） 。

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总之，“机器猫”和“印第安纳迷宫”这两个任务都被证明是检测小鼠先天防御反应的有效工具。此外，“印第安纳迷宫”任务还能同时评估抑制性回避行为。通过这两个任务，我们得以证明，HAB小鼠表现出适应不良的防御反应水平，而LAB小鼠则在逃避迫在眉睫的威胁时存在严重缺陷。

02、LAB 小鼠完全视网膜失明

LAB 小鼠对接近物体的显著无视，促使我们去探寻其视觉感知方面的差异。评估小鼠视力的一项标准测试是视动反应（OMR）测试）。该测试基于小鼠对水平移动条纹的追踪行为。测试时，将小鼠置于一个固定平台上，平台位于一个带有不同宽度条纹的旋转圆筒内，以此检测小鼠视力（图 3A 插图）。我们对这一测试流程进行了修改，使其适用于五个小鼠品系（B6、CD1、HAB、NAB 和 LAB），具体做法是仅使用一种相对较大的光栅（0.5 周期 / 度），并且只要小鼠的头部运动方向与圆筒旋转方向一致，就对每次头部运动进行计分。

图 2. 两种基于动物行为学设计的新测试情境揭示 HAB 和 LAB 小鼠先天防御反应的极端情况A) “机器猫” 任务中获得的三种不同行为指标，其表现会被记录：逃跑、绕过和碰撞。B) 使用 “机器猫”，我们研究了 HAB（N = 7，红色）、NAB（N = 6，绿色）和 LAB（N = 9，蓝色）小鼠的恐惧反应（采用 Fisher 精确检验进行分析）。数值为至少表现出一次相应行为的小鼠百分比。C) “印第安纳迷宫”（默认）操作流程的示意图，以及不同的行为指标（首次离开潜伏期 I、探索结束潜伏期 II 和逃跑反应 III）。我们使用 “印第安纳迷宫” 测试了不同组别的 HAB（N = 24）、NAB（N = 19）和 LAB（N = 20）小鼠。D) 首次离开潜伏期的量化数据；黑色实心圆圈表示未离开起始臂的小鼠，HAB（N = 7）、NAB（N = 0）和 LAB（N = 4），这些小鼠被排除在单因素方差分析之外。E) 探索场地的小鼠数量的量化数据。F) 排除如 D 中所示完全未进入场地的小鼠后，探索结束潜伏期的量化数据。注意：如果小鼠离开了起始隔间，它们都会以相当的活力探索完整个场地。G) 在与接近的聚苯乙烯泡沫球三次接触中，至少出现一次恐惧反应的量化数据（这包括抢先出现的恐惧反应，以及球击中动物后的恐惧反应）。H) 另一组 HAB 小鼠接受地西泮（DZP，1mg/kg，腹腔注射）（N = 13）或溶媒（VHC，生理盐水，N = 12）处理后，进行 “印第安纳迷宫” 测试，并对首次离开潜伏期进行量化。星号表示通过 Mann - Whitney 检验获得的显著性值，* = p < 0.05；美元符号表示通过卡方检验或 Fisher 精确检验获得的显著性值，$ p < 0.05，$$ p < 0.01，$$$ p < 0.001；井号表示通过单因素方差分析后，再进行 Newman - Keuls 多重比较检验获得的显著性值，### p < 0.001。数值以平均值 ± 标准误表示。

因此，我们采用该测试来评估小鼠的整体视觉能力，而非单纯的视力。通过这种方法，我们观察到不同品系小鼠之间存在显著差异（图3A；F₄,₅₄ = 93.13，p < 0.0001）。B6品系小鼠的表现远超其他所有品系（B6小鼠每分钟视动反应次数为16.9 ± 0.9次），而在白化小鼠品系中，HAB小鼠的反应最为强烈（每分钟视动反应次数为5.5 ± 0.8次）。CD1小鼠（每分钟视动反应次数为2.6 ± 0.7次）和NAB小鼠（每分钟视动反应次数为2.4 ± 0.5次）的反应相似，但LAB小鼠几乎未表现出明显的视动反应（每分钟视动反应次数为0.2 ± 0.1次 ）。由于有报道称LAB小鼠在某些表型上与注意缺陷多动障碍（ADHD）存在相似之处，我们不能排除这些小鼠能够感知视觉刺激，但无法集中注意力，因而未能做出适当反应的可能性。因此，我们对所有五个小鼠品系的视网膜功能进行了研究，采用的方法是对麻醉后的小鼠进行闪光视网膜电图（fERG）测量。fERG的测量装置（如图3B顶部所示）包含一个通常用于体内细胞外神经记录的差分放大器，参考电极放置在遮蔽的眼睛上。另一只眼睛则由定制的微型眼杯进行刺激，眼杯配备有白色LED，并与定制的LED驱动器配合使用。该装置能够可靠地检测视网膜电图信号，并分离出fERG的b波成分（图3B底部）。在暗适应（暗适应时间大于3小时）以及三种不同闪光强度（0.23、128和1.69 log光异构化·杆细胞⁻¹·秒⁻¹）的明视条件下采集的fERG，显示B6、CD1、HAB和NAB小鼠（每个品系N = 6）都有明显的信号偏转（图3C）。然而，在LAB小鼠（N = 6）中，未检测到任何电生理反应（暗适应条件下：组间差异F₄,₂₅ = 14.38，p < 0.0001，图3D；明视条件下：组间差异F₄,₂₅ = 8.77，p = 0.0001，双向重复测量方差分析；图3E）。为进一步确定无视网膜电图反应的原因，对所有品系（每个品系N = 3，右眼）的视网膜切片进行了组织学分析，结果发现LAB小鼠的外核层（ONL）以及下方的内/外节段（IS/OS）缺失（图3F）。由于LAB小鼠的原代品系（CD1）已知存在隐性rd1视网膜变性的情况，我们对所有品系（每个品系N = 4，取尾巴组织活检）进行了聚合酶链反应（PCR）基因分型筛查。该检测（图3G）显示，LAB小鼠在Pde6brd1 + / + 等位基因上呈现纯合突变，这表明其发生了视网膜变性1型突变，该突变会导致小鼠出生后不久即失明。因此，可以得出结论，LAB小鼠（测试时年龄为3 - 6个月）患有完全性视网膜失明，这就是它们无法逃避像机器猫这样接近的威胁性刺激的原因（图2B）。但失明并不能解释为什么在印第安纳迷宫任务中，即便被球击中，仍只有40% 的LAB小鼠表现出逃跑反应（图2G）。

图 3. LAB 小鼠完全视网膜失明(A) 在 500 勒克斯光照下，对 B6、CD1、HAB、NAB、LAB 小鼠（每组 N = 12）测量视动反应（OMR）。插图展示了处于 OMR 测试装置中的一只 HAB 小鼠。通过单因素方差分析后进行 Newman - Keuls 多重比较得出的显著性值，与 LAB 小鼠相比用星号表示，B6 小鼠与其他所有小鼠品系相比用井号表示。(B) 麻醉小鼠视网膜电图测量装置的简化示意图。b 波通常与米勒细胞和 ON 双极细胞的活动相关。(C) 在暗适应和明视条件下，以三种不同闪光强度对 B6、CD1、HAB、NAB、LAB 小鼠（每组 N = 6）测量视网膜电图。(D) 暗适应 ERG 的量化结果和 (E) 明视测量的量化结果。星号表示通过双因素方差分析后进行 Bonferroni 事后检验得出的显著组间效应。(F) 对 B6、CD1、HAB、NAB、LAB 小鼠（每组 N = 3，仅右眼）30 微米厚的视网膜切片进行苏木精 - 伊红染色后的组织学分析。IS/OS：光感受器内 / 外节；ONL：外核层；OPL：外网层；INL：内核层；IPL：内网层；GCL：神经节细胞层。(G) 对 Pde6brd1 + / + 等位基因（视网膜变性 1 型）的聚合酶链反应（PCR）筛查；bp：碱基对。显著性值用星号和井号表示（统计检验的详细信息在图注的相应部分给出）：* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，与 LAB 相比；### p < 0.001，与 CD1、HAB、LAB 和 NAB 相比。数值以平均值 ± 标准误表示。

03、逆转 LAB 小鼠的低焦虑表型

在 “机器猫” 任务中，LAB 小鼠在躲避接近威胁方面的严重缺陷可归因于它们的视网膜变性。然而，在 “印第安纳迷宫” 任务中，被球击中后的躲避行为也被视为恐惧反应，此时很明显 LAB 小鼠对触觉刺激的反应性也有所降低。因此，有必要确定这种行为异常是否可归因于特定脑区的不同活动。

为了研究 LAB 小鼠与 NAB 小鼠相比的紧张性神经元活动变化，我们对 HAB（N = 31）、NAB（N = 26）和 LAB（N = 30）小鼠进行了锰增强磁共振成像（MEMRI）（错误发现率 FDR p <0.001，聚类范围> 20），采用 3 级全因子设计的体素分析方法（完整的 MEMRI 数据集见相关内容）。通过对 MEMRI 数据进行两两比较（即 HAB 与 NAB、LAB 与 NAB）得出的结果表明，LAB 小鼠的上丘深层和中层腹侧部分（中脑导水管周围灰质外侧）锰积累减少（图 4A）。该结构接收来自初级和次级躯体运动区的密集输入（艾伦脑图谱，连接性，实验编号 #180719293，#180709942）。

为了评估该脑区在 LAB 小鼠行为表型形成中的功能关系，我们采用了最近开发的 DREADD 方法。将激活型 DREADD hM3Dq 与报告蛋白 mCherry 融合，在 CaMKII 启动子的控制下，使用腺相关病毒载体（AAV5 - CaMKII - hM3Dq - mCherry，N = 11）或对照病毒（AAV5 - CaMKII - mCherry，N = 12）在上丘（ML 0.9mm，AP - 3.64mm，DV - 1.75mm）中表达。图 4B 展示了病毒表达的一个示例图像。这种方法导致整个上丘被标记（详细的组织学验证见 A）。

在超过 5 周的潜伏期后，所有动物都接受 “印第安纳迷宫” 测试。在测试当天，每只动物在试验前 45 分钟腹腔注射 1mg/kg 的氯氮平 - N - 氧化物（CNO）（由于实验组和对照组动物接受相同剂量的 CNO，先前发现的氯氮平转化后的副作用无法解释行为变化）。表达 hM3Dq 的实验动物离开起始隔间的潜伏期显著增加（Mann - Whitney 检验，U₁ = 94，n₂ = 182，U = 16.00，p = 0.0023；1282.0 ± 185.4 秒 vs. 265.5 ± 113.6 秒；图 4C）。此外，在 30 分钟内只有 64% 的表达 hM3Dq 的动物离开了起始隔间（图 4D）（Fisher 精确检验，p = 0.0373）。探索结束潜伏期也增加了（216.0 ± 62.7 秒 vs. 51.0 ± 25.3 秒；Mann - Whitney U 检验；U₁ = 86，n₂ = 104，U = 8.00，p = 0.0046；图 4E）。恐惧反应性（图 4F）在转染 hM3Dq 的小鼠中增加到 71%，而在 mCherry 对照组中为 9%（Fisher 精确检验，p = 0.0095）。

接下来，我们测试这种通过药物遗传学增强的防御反应模式是否也反映在高架十字迷宫（EPM）上的行为变化中（“印第安纳迷宫” 任务一周后，实验前 45 分钟注射 CNO；图 4G）。与 “印第安纳迷宫” 的起始部分类似，接受 1mg/kg CNO 处理的 hM3Dq 动物进入开放臂的潜伏期增加（85.6 ± 12.9 秒 vs. 27.4 ± 2.4 秒）（U₁ = 69.5，n₂ = 183.5，U = 3.500，p = 0.0002）。这伴随着在开放臂上停留时间的百分比降低（61.9 ± 4.2% vs. 76.0 ± 3.3%，U₁ = 183，n₂ = 93，U = 27.00，p = 0.0178），在封闭臂上停留时间的百分比增加（33.6 ± 4.3% vs. 18.3 ± 3.0%，U₁ = 100.5，n₂ = 175.5，U = 22.50，p = 0.0081）以及运动活性降低（7.1 ± 0.7 米 vs. 9.7 ± 1.0 米，U₁ = 179，n₂ = 97，U = 31.00，p = 0.0337）。在中央区域的停留时间不受影响（见 B）。

LAB 小鼠在 EPM 上部分逆转的行为表型可能是由于活性 DREADD 的非特异性作用导致的被动性增加。然而，hM3Dq 动物中主动风险评估行为的次数增加（图 4H）（13.0 ± 1.4 次 vs. 4.0 ± 0.7 次）表明防御反应水平更高（U₁ = 56.5，n₂ = 174.5，U = 1.5，p = 0.0002）。此外，在 EPM 的前 5 分钟内，伸展注意姿势（SAP）的持续时间也增加了（8.9 ± 2.4 秒 vs. 2.0 ± 0.6 秒）（hM3Dq 与时间的交互作用：F₂,₃₈ = 3.59，p = 0.0375，双向重复测量方差分析）。

综上所述，这些结果表明，即使在失明的 LAB 小鼠中，上丘神经元活动的升高也会增加对开放臂的回避和风险评估行为。此外，对上丘的药物遗传学刺激可以部分恢复对触觉刺激的防御反应缺陷。

图 4. 逆转 LAB 小鼠的低焦虑表型(A) LAB 小鼠（N = 30）与 NAB 小鼠（N = 26）的锰增强磁共振成像（MEMRI）结果显示，LAB 小鼠上丘深层和中层的 Mn²⁺积累显著减少。与 NAB 小鼠相比，暖色调表示积累增加，冷色调表示 LAB 小鼠中积累减少。颜色亮度表示显著性值。星号标记的是由于脑模板的线性差异，在导水管内及上丘上方出现的信号伪影。(B) 与 MEMRI 数据切片位置大致相同的脑切片示例，描绘了上丘水平的病毒表达范围（品红色）。蓝色显示的是细胞核 4’,6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚（DAPI）复染。叠加的是上丘（SC）和中脑导水管周围灰质（PAG）的轮廓。星号标记的是切片过程中出现的组织损伤。使用印第安纳迷宫任务研究上丘内 hM3Dq 激活的效果。图中展示了首次离开潜伏期（C）、探索场地的动物百分比（D）、探索结束潜伏期（E）以及对球表现出恐惧反应的动物百分比（F）。所有动物在测试前 45 分钟均接受 1mg/kg 氯氮平 - N - 氧化物（CNO）处理。(G) 此外，对相同的动物进行高架十字迷宫（EPM）行为测试（30 分钟），并评估前 5 分钟内的出现潜伏期、开放臂（OA）停留时间、封闭臂（CA）停留时间和运动量。(H) 此外，对主动风险评估参数，即伸展注意姿势（SAP）的总数以及 SAP 随时间的持续时间（0 - 15 分钟）进行评分。除非另有说明，星号表示通过 Mann - Whitney 检验获得的显著性值，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001；美元符号表示通过 Fisher 精确检验获得的显著性值，$ p < 0.05，$$ p < 0.01。通过双向重复测量方差分析，随后进行 Bonferroni 事后检验获得的显著性值用 bf 表示。数值以平均值 ± 标准误表示。

05、逆转 HAB 小鼠的高焦虑表型

与研究 LAB 小鼠类似，我们采用锰增强磁共振成像（MEMRI）方法，来识别可能构成 HAB 小鼠适应不良防御反应模式以及其对开放臂回避行为增加的神经回路。我们发现一个显著的脑结构，即腹外侧、外侧（l）和背外侧（dl）中脑导水管周围灰质（PAG），其锰积累增加（图 5A；完整的 MEMRI 数据集见相关内容）。

为评估 PAG 在 HAB 小鼠行为表型形成中的功能关系，我们植入导向套管，靶向背外侧 / 外侧 PAG（ML 0.6mm，AP - 4.25mm，DV - 2.45mm，针头伸出 500μm），并在每次实验前 45 分钟注射 53.24ng/100nl（每侧半球）的荧光标记蝇蕈醇（MUSC），这是一种强效的 GABAA 受体激动剂，相当于 10ng/100nl 的普通蝇蕈醇。图 5B 展示了一个描绘蝇蕈醇扩散的示例图像。所有动物（N = 11）的蝇蕈醇扩散范围见 A 部分，除了外侧 PAG，还包括背外侧 PAG 以及部分上丘的深层和中层。

为测试外侧 PAG 内增强的 GABA 能信号是否会改变 HAB 小鼠极端的开放臂回避行为，我们对注射溶媒（人工脑脊液 aCSF，N = 6）或蝇蕈醇（MUSC，N = 5）的 HAB 小鼠（由于注射缺陷，1 只注射溶媒和 2 只注射蝇蕈醇的动物被排除在分析之外）在高架十字迷宫（EPM）上的行为进行了测试（图 5C - H）。结果显示，仅 20% 注射溶媒的动物进入开放臂，而所有注射蝇蕈醇的动物都轻易进入了开放臂（Fisher 精确检验，p = 0.0152；图 5C + D）。此外，注射蝇蕈醇的动物在开放臂上花费的时间显著增加（Mann - Whitney 检验，U₁ = 16，n₂ = 50，U = 1.000，p = 0.0116；44.4 ± 9.4% vs. 3.2 ± 3.2%；图 5E），在封闭臂上花费的时间减少（U₁ = 44，n₂ = 22，U = 1.000，p = 0.0087；45.0 ± 9.3% vs. 88.1 ± 5.8%；图 5F），并且运动增加（17.6 ± 2.2 米 vs. 8.0 ± 1.2 米，U₁ = 15，n₂ = 61，U = 0.0，p = 0.0043；图 5G）。在中央区域的停留时间不受影响（见 B 部分）。这些观察结果表明，对开放臂的回避行为减少，但这可能受到活动增加的干扰。因此，注射蝇蕈醇（MUSC）的HAB小鼠主动风险评估行为减少（此前研究表明该行为对全身性地西泮治疗敏感，见图1F）（图5H），即伸展注意姿势（SAP）的数量（注射MUSC组为5.0 ± 3.5次，注射溶媒VHC组为19.6 ± 3.4次，Mann - Whitney检验，U₁ = 45，n₂ = 21，U = 0.0，p = 0.008），这进一步支持了防御反应的降低。此外，在高架十字迷宫任务的前5分钟内，SAP的持续时间显著减少，组间效应显著（F₁,₉ = 13.71，p = 0.0049，双向重复测量方差分析；图5H）。最后，所有动物连续两天每天接受一次5分钟悬尾实验（TST），以测试其鸣叫倾向，采用交叉设计。一半的动物接受溶媒或蝇蕈醇处理，次日处理方式互换。在5分钟的TST中，86%接受溶媒处理的HAB小鼠至少发出一次可听声鸣叫，而接受蝇蕈醇处理的动物无一鸣叫（Fisher精确检验，p < 0.0001；图5I）。所有鸣叫均在可听声范围内。图5J（上图）展示了发出可听声鸣叫的HAB小鼠的频谱分析（两只小鼠因鸣叫倾向低且仅发出短鸣叫而被排除）。显然，HAB小鼠鸣叫的主导频率为4090Hz，一次谐波为8180Hz。所有记录均使用超声传感器进行，并通过外差式耳机输出在线评分，因此可以排除接受蝇蕈醇处理的动物仅在超声波范围内鸣叫的可能性。图5J（下图）展示了一个典型的可听声鸣叫示例，其主导频率在4kHz范围内，共振峰谐波高达约16kHz。在某些鸣叫中（白色星号处），我们可以看到这些谐波甚至高达40 - 50kHz，然而这些信号并不类似任何典型的啮齿动物超声波鸣叫。这些结果表明，HAB小鼠中脑导水管周围灰质（PAG）的紧张性激活增加，表现为过度的开放臂回避行为以及强烈的发出可听声鸣叫的倾向，而低剂量的蝇蕈醇可以逆转这种情况。

图 5. 逆转 HAB 小鼠的高焦虑表型(A) HAB 小鼠（N = 31）与 NAB 小鼠（N = 26）的锰增强磁共振成像（MEMRI）显示，HAB 小鼠的中脑导水管周围灰质（PAG）中 Mn²⁺积累显著增加。(B) 与 MEMRI 图像切片位置大致相同的脑切片示例，描绘了在中脑导水管周围灰质水平，荧光标记的蝇蕈醇（MUSC）的扩散范围（品红色）。蓝色显示的是细胞核 DAPI 复染，并叠加了上丘（SC）和中脑导水管周围灰质（PAG）的轮廓。星号标记因套管放置造成的组织损伤。(C) 注射溶媒（VHC）和蝇蕈醇（MUSC）的 HAB 小鼠在高架十字迷宫（EPM）上的运动轨迹示例。对注射 VHC（N = 5）或 MUSC（N = 6）的 HAB 小鼠进行 EPM 行为测试（30 分钟），并评估前 5 分钟内进入开放臂（OA）的动物百分比（D）、开放臂停留时间（E）、封闭臂（CA）停留时间（F）和运动量（G）。(H) 此外，对主动风险评估参数，即伸展注意姿势（SAP）的总数以及 SAP 随时间（0 - 15 分钟）的持续时间进行评分。(I) 最后，对动物（N = 14）采用交叉设计，分别用 VHC 和 MUSC 处理，并进行 5 分钟悬尾实验（见示意图），以检测其鸣叫倾向。(J) 上图：HAB 小鼠（N = 10）发出鸣叫的频谱分析。黑色表示平均值，蓝色表示标准误。水平虚线表示主导频率 4090Hz 和一次谐波 8190Hz。中图：一只 HAB 小鼠的典型鸣叫；原始信号的包络曲线。下图：同一鸣叫的声谱图。注意谐波的共振峰结构。星号表示在 40 - 50kHz 范围内罕见且轻微的超声伪影，这是由于呼出的空气本身造成的。除非另有说明，星号表示通过 Mann - Whitney 检验获得的显著性值，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001；美元符号表示通过 Fisher 精确检验获得的显著性值，$ p < 0.05，$$ p < 0.01。通过双向重复测量方差分析，随后进行 Bonferroni 事后检验获得的显著性值用 bf 表示。数值以平均值 ± 标准误表示。

四、讨论

实验者无法直接了解实验动物在焦虑、恐惧和惊恐状态下的内心感受。相反，只能依赖行为和生理指标来判断。由于焦虑、恐惧和惊恐的行为表现具有相当的连续性，这些状态似乎是动物防御生存回路的一种功能体现。虽然这并不妨碍对观察到的指标进行分类，但排除了将特定内心状态简单归属于某一行为类别的可能性。在描述本研究结果时，我们仅将 “回避” 用于动物能控制自身暴露于威胁情境的情况（应急任务），将 “主动风险评估” 用于伸展注意姿势的表现，将 “防御反应” 用于定向和非定向逃跑以及强直性静止（僵住）。

先前有研究利用高架十字迷宫（EPM）探究近交系小鼠开放臂回避行为改变的神经药理学基础，结果表明，全身性给予苯二氮䓬类药物具有一致的剂量依赖性抗焦虑作用，这强调了该测试情境的预测效度。最近更多研究评估特定脑区在大鼠和小鼠开放臂回避行为的表达和调节中的作用，涉及的脑区包括前额叶皮质（PFC）、终纹床核（BNST）、外侧隔核（LS）至下丘脑前区（AHA）的投射、内侧隔核（MS）、隔 - 缰核通路、基底外侧杏仁核（BLA），特别是其向杏仁核中央核（CeA）和腹侧海马（vHPC）以及 PFC的投射、vHPC 至 PFC 的投射、vHPC - 外侧下丘脑区（LHA）的投射、缰核（Hb）、脚间核（IPN）、外侧背盖核（LdT），还有中脑导水管周围灰质（PAG）以及上丘（SC）。

显然，所有这些脑结构并非介导相同类型和方面的回避行为（例如社交、嗅觉、视觉和听觉线索），但它们都对相同的行为输出产生调节作用。尽管这一系列潜在涉及的神经回路在初始行为筛选方面可能具有优势，但对 EPM 上观察到的行为进行解读时需要格外谨慎。因此，将这种行为简单称为 “焦虑样” 行为是一种过度简化的说法。在本研究中，我们展示了从一些小鼠品系获得的数据，这些小鼠品系的培育基于一个简单假设，即开放臂回避水平可作为焦虑的替代指标。

需要注意的是，与小鼠中针对开放臂回避行为的双向选择性育种类似，早期在大鼠中也有类似的研究方法，培育出了高焦虑和低焦虑行为表现的大鼠。然而，尽管从HAB/LAB大鼠研究中获得的发现与临床前焦虑研究高度相关，但对其的讨论超出了本研究的范围。我们已经表明，基于在高架十字迷宫（EPM）上的行为，通过对所谓焦虑样行为的极端情况进行选择性育种得到的两个小鼠品系（HAB和LAB小鼠），其开放臂回避表型伴随着防御反应水平的平行变化。这通过两种新的多感官行为范式（“机器猫”、“印第安纳迷宫”）得以证明，这些范式允许重复评估小鼠对接近的威胁性刺激的先天逃避行为。此外，我们发现LAB小鼠由于Pde6brd1 + / + 等位基因的纯合突变而缺乏功能性视网膜，这表明发生了视网膜变性1型（rd1）突变，导致小鼠出生后不久即失明。尽管如此，在LAB小鼠的上丘（SC）中，运用基于锰增强磁共振成像（MEMRI）引导的体内神经元回路研究方法，并使用激活型 Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs（DREADD）—— hM3Dq，我们得以证明，增强中脑多感官整合回路内的神经元活动，即便对于失明的动物，也足以提高其先天防御反应水平，最终在高架十字迷宫（EPM）测试中表现为开放臂回避行为的增加。此外，采用类似的方法，将强效的GABAA受体激动剂蝇蕈醇局部注射到HAB小鼠的中脑导水管周围灰质（PAG）中，我们发现，在这种情况下，调节中脑生存回路内的神经元活动，同样足以逆转其占主导的开放臂回避表型。

01、选择性育种的多维度本质

自下而上的方法（从特定的基因改变、神经元亚群或脑结构出发）和自上而下的方法（从独特的行为表型出发），都有望破解焦虑样行为的分子和细胞基础。后者包括选择性育种，它允许在多基因背景下研究行为表型，这与大多数精神疾病的情况相似。该方法假定，由此产生的焦虑样行为的极端情况反映了相同行为特征在正常分布中的极端情况。因此，预计对这两种极端情况进行直接比较，将提供最佳的信噪比，以理清表型的分子和细胞相关性。

事实上，通过杏仁核回路的活动传播似乎支持了从 HAB 经 NAB 到 LAB 表型的维度转变，并且许多行为读数也呈现出类似的模式（见表 1）。然而，本研究表明，如果不完全错误的话，这种策略可能会产生误导：首先，对依赖活动的 Mn²⁺积累差异的测量并未揭示出与 NAB 小鼠相比，HAB 和 LAB 小鼠中有任何一个脑结构的信号强度呈现双向变化。其次，我们发现感觉知觉受损是 LAB 小鼠忽视威胁的一个潜在原因。rd1 突变在许多小鼠品系种群中自由分离，包括 CD1（用于选择性育种初始步骤的祖先品系）。它代表光感受器磷酸二酯酶 6b（Pde6b）中的无义突变。在纯合的情况下，这种隐性突变会导致光感受器丧失和视网膜变性。可以想象，LAB 小鼠的选择性育种至少部分基于对 rd1 及其导致的先天性失明的共选择。由于缺乏相关资料，我们无法追溯自 15 年前 LAB 品系建立以来首次出现纯合性的时间点。无论如何，过去通过直接比较 LAB 与 HAB 获得的数据必须极其谨慎地（重新）解读。

02、体内成像

我们采用体内锰增强磁共振成像（MEMRI）来研究焦虑样行为极端情况的神经基础。与测量急性暴露于威胁情境时神经元活动瞬时变化的即刻早期基因表达或放射性葡萄糖衍生物积累不同，反复注射氯化锰（MnCl₂）有望使锰离子（Mn²⁺）在脑内积累，甚至在神经元活动有紧张性（即持续性）变化的细胞中也能积累。重要的是，MEMRI 具有无创性地绘制全脑活动图谱的潜力。Mn²⁺通过电压门控钙通道进入活动的神经元，在细胞内短暂留存，并优先在投射末端积累，这表明它可用于连接组分析。尽管我们的动物没有受到明确的刺激，但需要注意的是，注射过程本身可能作为一种急性应激源，在不同小鼠品系中引发不同的神经反应。事实上，小鼠在接受 Mn²⁺处理后会出现显著的皮质酮分泌，随着反复注射，这种分泌会逐渐减少。

体素层面的比较显示，与NAB小鼠相比，HAB或LAB小鼠中有多种脑结构的Mn²⁺积累量较低或较高。对其中每一个结构进行详细讨论远远超出了本研究的范围。我们仅提及一些突出（且出乎意料）的发现，例如LAB小鼠中的苍白球（GP）和HAB小鼠中的隔 - 海马系统。苍白球主要与运动和联想功能相关。然而，它似乎在厌恶行为（包括恐惧和焦虑）的表达中也起着重要作用。在威胁情境回避测试中，向苍白球局部施用血清素和谷氨酸可有效抑制焦虑样行为，而促肾上腺皮质激素释放因子受体1的下调则会产生焦虑样效应。关于苍白球在焦虑介导行为中关键作用的进一步临床证据在于，对抑郁症患者以及帕金森病患者进行苍白球深部脑刺激时，伴随焦虑症状的减轻。我们不能完全排除苍白球活动的差异可能与品系间一般运动活动的差异有关。然而，人们会认为，如果存在运动活动增加的情况，应该会导致运动网络中Mn²⁺积累增加，从而产生LAB > NAB的效应，而不是LAB < NAB。我们发现HAB小鼠的隔 - 海马系统激活增加，鉴于其与广泛性焦虑症的潜在关联），这一发现尤其有趣。有报道称，隔区损伤会增加在高架十字迷宫开放臂上停留的时间，并减少掩埋电击探针的时间，向大鼠隔区局部施用精氨酸加压素受体拮抗剂会增加在高架十字迷宫开放臂上停留的时间。表达促肾上腺皮质激素释放因子受体2的隔区神经元投射到下丘脑并促进焦虑样行为。海马也与焦虑样行为有关，特别是其腹侧部分。因此，很容易假设，HAB小鼠海马中因Mn²⁺积累增加所表明的较高活动状态，与这些动物表现出的过度恐惧和焦虑样行为存在因果联系。对恒河猴的正电子发射断层扫描（PET）研究支持了这一解释，该研究报告称，高度焦虑动物的海马脑活动增加。有趣的是，LAB小鼠在海马结构中也显示出较高的Mn²⁺积累，这似乎与我们的解释相矛盾。然而，我们在背侧齿状回水平观察到一个显著信号，该区域之前已被证明与过度活动和焦虑降低有关，这与LAB小鼠的表型相符。

03、中脑结构控制开放臂回避程度、风险评估及防御行为

在众多 Mn²⁺积累量不同的脑结构中，中脑 / 顶盖的部分区域也呈现出信号强度的变化，如 LAB 小鼠的上丘和下丘信号强度降低，而 HAB 小鼠的中脑导水管周围灰质（PAG）信号强度增强。上丘是一个多模态感觉 - 运动结构，接收来自视网膜和躯体感觉皮层的输入。上丘发出的传出信号会引发多种防御反应。因此，上丘活动状态降低可能既反映了感觉输入减少（即威胁探测减少；），也反映了威胁反应减弱。单纯的生理性失明不足以解释 LAB 小鼠在印第安纳迷宫（即便与聚苯乙烯泡沫球接触后仍未表现出逃跑反应）和高架十字迷宫（风险评估水平低）中的行为表型。事实上，我们可以通过化学遗传学方法激活上丘来减轻这种 “情感性失明”。

在 HAB 小鼠中，增强的 Mn²⁺积累覆盖了 PAG 的整个尾部区域，这与 HAB 小鼠在高架十字迷宫开放臂中 c - Fos 表达增强的情况类似。PAG 腹侧部分的活动增加，与 HAB 小鼠更倾向于表现出被动防御反应相符（另见表 1）。

04、背侧部分活动增加更令人惊讶，因为它们与主动防御反应相关

直到最近，我们才证明 HAB 小鼠对接近的机器甲虫表现出过度的主动恐惧，这与本研究中 HAB 小鼠对机器猫的过度逃跑反应一致。值得注意的是，背侧 PAG 的失活导致了该小鼠品系在高架十字迷宫行为上迄今为止最显著的变化。这也体现在风险评估的降低以及防御性发声的完全缺失上。

05、关于恐惧与焦虑

在动物实验中，焦虑状态通常通过基于探索或互动的任务进行评估，这些任务涉及接近 - 回避冲突）。仅靠回避指标不足以描述行为表型，因为它们可能会受到探索驱动力变化的干扰。因此，强烈建议额外评估那些反映对（潜在）威胁环境 / 物体接近行为的行为参数。

在此，我们报告了 HAB 和 LAB 小鼠与 NAB 小鼠相比，在高架十字迷宫中风险评估的双向变化，这些变化对地西泮治疗敏感，并且可以通过对中脑 / 顶盖结构的药理学或化学遗传学干预来逆转。相比之下，开放臂探索对地西泮不敏感，因此似乎不太适合作为焦虑样行为的衡量指标。这可能归因于多代的严格选择过程，以及高度和开放空间相结合所带来的威胁强度。

因此，在印第安纳迷宫的第一阶段，当小鼠必须离开起始隔间去探索由侧边和末端臂环绕的空心通道时，HAB 小鼠的应急潜伏期显著增加。然而，这次这个参数对地西泮治疗敏感，可能是因为测试情境的威胁性影响较小。重要的是，HAB 小鼠一旦离开起始隔间，就会欣然探索整个装置。因此，高架十字迷宫或印第安纳迷宫探索中的差异不能归因于一般的动机 / 探索驱动力或运动行为的缺乏，而是归因于状态焦虑。

为了研究焦虑样行为极端情况对明确威胁的防御反应的影响，我们决定开发基于动物行为学的任务，这些任务可以测量主动防御反应与防御距离的函数关系，并判断其适应性与非适应性本质。在印第安纳迷宫中，小鼠会面对一个接近的聚苯乙烯泡沫球，这个球占据了空心通道的整个宽度。HAB 和 NAB 小鼠都会躲避这个球，而 LAB 小鼠的行为明显是非适应性的，因为几乎所有小鼠至少有一次被球追上（但未受到身体伤害）。如前所述，上丘神经元活动的增加在大多数动物中重新建立了逃跑行为，这表明不仅仅是感觉缺陷（即生理性失明）可以解释防御行为的缺陷。

机器猫实验也呈现出类似的情况，该机器猫与之前描述的类似。同样，LAB 小鼠与机器猫碰撞的风险很高。这次，HAB 小鼠的行为也被证明是非适应性的，因为没有一只小鼠能够绕过机器猫，即使没有与它碰撞的风险。结合我们之前观察到的 HAB 小鼠对接近的机器甲虫的回避增加，这一发现表明，在高架十字迷宫中对高焦虑样行为的选择与过度的防御反应同时出现，包括被动防御反应（见表 1）和主动防御反应。

五、结论

通过使用具有极端焦虑样行为的成熟小鼠品系，我们证明了：

焦虑程度的极端化与以下几点相关：

对接近威胁的防御反应的极端化；

神经元活动的紧张性变化，尤其是在中脑 / 顶盖结构中；

若这些变化得到逆转，恐惧和焦虑样行为会得到改善。

此外，我们提供的证据表明，防御行为增加或减少具有多维度性质，其中可能包括感觉知觉缺陷。

我们的研究结果对在描述小鼠在高架十字迷宫或其他基于探索的任务中的行为时，不加批判地使用拟人化术语 “焦虑” 或 “焦虑样” 提出了挑战，因为这些术语暗示了更高层次的认知过程，而这在小鼠行为中不一定存在。对高度（恐高症）和 / 或开阔空间（广场恐惧症）的明确恐惧，足以解释小鼠对开放臂探索的缺失。

最近引发的关于在更适合用 “威胁” 一词时却不加批判地使用 “恐惧” 一词的讨论，促使科学界重新审视其术语，尽管 “恐惧” 一词仍有其价值。如果我们在动物行为的转化研究中不加批判地使用 “焦虑” 一词，将会面临一个类似甚至更突出的问题。相反，我们应该按照防御反应的实际情况来描述它们，最好依据捕食迫近模型的连续体来进行描述。

01.方法与材料

实验动物

使用了以下品系的成年（3 - 8 个月）雄性小鼠：C57BL/6N（B6）（N = 12）、HAB（N = 154）、NAB（N = 76）、LAB（N = 99）、CD1（N = 12），总计 353 只动物。所有动物均在德国马丁斯里德的马克斯・普朗克生物化学研究所的动物设施中繁殖。动物以 2 - 4 只为一组饲养在标准条件下：12 小时光照 / 12 小时黑暗的颠倒光暗循环（早上 8 点关灯），温度 23 ± 1°C，食物和水可自由获取

实验程序已获得德国巴伐利亚州（慕尼黑上巴伐利亚行政区政府，许可证号：55.2 - 1 - 54 - 2531:44 - 09、188 - 12、142 - 12、133 - 06、08 - 16）的批准。动物饲养和实验严格按照欧洲经济共同体（EEC）关于实验动物护理和使用的建议（2010/63/EU）进行。我们尽一切努力减少实验对象的数量，并避免动物遭受任何痛苦。

药物

抗焦虑药物地西泮（Diazepam - Lipuro®，德国布劳恩梅尔松根公司）用生理盐水（溶媒）稀释，以 1mg/kg 的剂量腹腔注射，每 10g 体重注射 100μl。氯氮平 - N - 氧化物（CNO，Tocris 公司，产品编号 4936）溶解在二甲基亚砜（DMSO，Sigma - Aldrich 公司，产品编号 472301）中，配制成 75mM 的储存液，储存于 - 20°C。使用时，CNO 在生理盐水中的终浓度为 292μM（1mg/kg，每 10g 体重注射 100μl，DMSO 含量 < 0.5%）。蝇蕈醇（MUSC，Sigma - Aldrich 公司，产品编号 M1523）和荧光标记的蝇蕈醇（fMUSC，BODIPY® TMR - X 共轭物，赛默飞世尔科技公司，产品编号 M23400）溶解在人工脑脊液（aCSF）中（Baarendse 等人，2008）。MUSC 的分子量为 114.1g/mol，而 fMUSC 的分子量为 607.46g/mol，是 MUSC 的 5.324 倍。在之前使用 MUSC 的实验中，我们发现 10ng/100nl（876.4μM）的浓度效果最佳，因此使用 53.24ng/100nl 的 fMUSC 以达到相同的生理效果。由于 fMUSC 水溶性较差，我们将 1mg fMUSC 溶解在 1.878ml aCSF 中，以获得 876.6μM 的最终即用浓度。高架十字迷宫（EPM）实验使用 MUSC，而鸣叫实验仅使用 fMUSC。鸣叫实验采用交叉设计：第一天，一半动物接受 fMUSC，另一半接受溶媒（aCSF）。第二天，处理方式互换。实验结束后 1 - 3 小时，接受 fMUSC 的动物经心脏灌注 4% 多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS），其余动物在次日再次注射 fMUSC，并在注射后 1 - 3 小时

02.行为测试

高架十字迷宫测试

高架十字迷宫（EPM）装置由两条开放臂（长 30cm，宽 5cm）和两条封闭臂（长 30cm，宽 5cm，高 15cm）组成，通过一个中央平台（长 5cm，宽 5cm）相连。EPM 的所有部分均由深灰色聚氯乙烯（PVC）制成。该装置架设在一张桌子（高 50cm）上方 37cm 处，桌子放置在光线较暗的实验房间（5m×4m）中央。开放臂处的光照强度（光通量）为 7 勒克斯。

在实验前，通过将每只实验动物从网格笼顶部提起 3 次，测试其发出可听声鸣叫的倾向。每次试验开始时，将动物放置在靠近中央平台且面向封闭臂的位置。每次试验持续 30 分钟，并进行录像。使用行为跟踪软件分析动物的行为，确定其在开放臂（OA）、封闭臂（CA）和中央区域（中央停留时间）所花费时间的百分比，以及总移动距离。为了使这些结果与文献中的其他 EPM 实验具有可比性，报告的是每次试验前 5 分钟的数据（潜伏期和伸展注意姿势（SAPs）除外）。

此外，由一位对实验条件不知情的有经验的观察者分析其他行为参数，包括每次试验前 15 分钟内 SAPs 的数量和持续时间，以及在整个 30 分钟试验期间首次完全进入开放臂（四只爪子都进入）的潜伏期。试验结束后，统计 EPM 装置上的粪便颗粒数量，作为自主神经唤醒的一个指标。两次试验之间，用含有洗涤剂的自来水清洁装置，随后用纸巾擦干。

03、机器猫任务

机器猫任务（该任务的详细解释见相关内容）的灵感来源于机器鳄鱼任务。它是一个四轮机器人（乐高头脑风暴机器人），配备有超声波测距仪，并编程设定为一旦在 50 厘米的传感器范围内检测到运动，就向前推进 25 厘米（速度为 25 厘米 / 秒）。尽管名为机器猫，但除了两个小纸板耳朵外，并没有特意将机器人伪装成猫的样子。

该任务在一个纵向的场地（高 35 厘米、宽 50 厘米、长 150 厘米）内进行，机器人放置在距离起始隔间（高 35 厘米、宽 50 厘米、长 12.5 厘米）125 厘米远的位置。进入场地需通过实验人员操作的滑动门，利用小鼠自然的探索驱动力（不使用诱饵、禁食或禁水），最终使小鼠与机器人相遇。一旦小鼠触发机器人，机器人的移动通常会引发小鼠强烈的逃跑反应，小鼠会返回起始隔间。

所有动物首先在没有机器猫的情况下，无限制地进入整个场地进行预暴露（滑动门打开）。在接下来连续的 3 天里，每只动物都要进行习惯化试验，包括在起始隔间适应 10 分钟（使小鼠形成一个 “家域”），随后在没有机器猫的场地内自由探索 10 分钟。第 4 天的测试试验以相同方式进行，只是将机器猫放置在场地中。在测试试验中，动物通常会多次触发机器猫。所有试验都进行录像，由一位对实验条件不知情的有经验的观察者离线分析行为。行为读数包括逃跑（触发 + 返回）、绕过（触发但能容忍接近的机器猫并绕过它）或碰撞，只要观察到至少一次就进行记录。只有至少触发机器猫一次的动物才纳入分析。

04、印第安纳迷宫任务

受电影《夺宝奇兵：法柜奇兵》的启发，印第安纳迷宫实验在一个狭窄且狭长的场地（高 35 厘米、宽 16 厘米、长 150 厘米）内进行，该场地被等分为六个间距为 25 厘米的区域。在场地的一端，连接着一个定制的小有机玻璃笼子（高 30 厘米、宽 16 厘米、长 25 厘米），里面铺有垫料，作为动物的起始隔间。场地本身向起始隔间微微倾斜，采用间接照明（<10 勒克斯）。动物要进入场地，必须跨过一个小障碍物（高 2 厘米），这能防止动物 “意外” 掉入场地，迫使它们明确决定何时开始探索。

在任务中，每只动物首先被放入起始隔间，最长可在 30 分钟内（以四爪踏入为准）进入场地（首次进入潜伏期）。一旦动物进入场地，记录其到达最后一个区域的时间（探索结束潜伏期）。探索结束后，动物通常会返回起始隔间，或者由实验人员轻轻引导其返回。动物会很快再次进入场地，但这次在最后一个区域会放置一个聚苯乙烯泡沫球（直径 15 厘米，重 100 克），一旦动物越过场地中线（75 厘米处），球就会以 25 厘米 / 秒的速度向动物滚去。动物的反应可能为：(a) 提前逃跑，或者球碰到自己后返回（这两种情况都计为防御反应）；或者 (b) 被球追上（但无身体伤害）并继续探索场地。这个行为范式中的威胁暴露部分最长持续 30 分钟，或者当动物与球相遇三次后结束。实验过程中，实验人员在不知小鼠品系的情况下在线记录行为。

05、视动反应测试

为评估雄性 C57BL/6N、CD1、HAB、NAB 和 LAB 小鼠（每组 N = 12）的视觉表现，采用转鼓任务测试动物的视动反应。该任务基于小鼠倾向于注视移动的垂直黑白条纹，并通过头部的短时间运动追踪其旋转。通过减小条纹宽度，需要更高的视力才能分辨这些条纹。

实验装置由一个旋转圆柱体（转鼓，直径 33 厘米，高 35 厘米）构成，其内壁贴有黑白交替的条纹图案，条纹宽度为 2.88 厘米，空间频率为 0.05 周 / 度（cyc/deg，r = 16.5 厘米，每个黑白周期的弧长为 5.76，角度为 20°）。在测试过程中，将小鼠放置在转鼓中心一个直径 11.5 厘米的方格网上，方格网距离转鼓底部 16 厘米。转鼓的旋转由一个定制的基于微处理器的电机驱动电路控制，该电路操控一个齿轮电机。转鼓的旋转速度设定为每分钟 2.5 转（rpm）。

测试时，先将小鼠放入转鼓适应 1 分钟（光照强度 500 勒克斯），随后转鼓顺时针旋转 60 秒，接着暂停 30 秒，再逆时针旋转 60 秒。所有实验均进行录像并离线分析（对毛色相同的品系，即 CD1、HAB、NAB 和 LAB，分析人员不知其具体品系），如果小鼠头部运动方向与转鼓旋转方向一致，则记为一次视动反应。这个原始任务的修改版本虽然不能对不同水平的视力做出详细判断，但足以评估所研究小鼠品系的总体视觉表现。

06、生理测量

为评估雄性 C57BL/6N、CD1、HAB、NAB 和 LAB 小鼠（每组 N = 6）的视网膜功能，对麻醉状态下的动物进行闪光诱发视网膜电图（fERG）测量。为此，在实验前将动物暗适应 3 小时以上。在昏暗的红光（650 纳米）照明下，对动物称重并给予镇痛处理（200 毫克 / 千克诺瓦金 / 美他米唑，皮下注射，以生理盐水配制成每 10 克体重 100 微升的浓度），随后将它们从饲养笼转移至麻醉箱（异氟烷 4%）。达到手术麻醉耐受程度（表现为眼睑反射和缩爪反射消失）后，将动物转移至改良的立体定位框架，通过异氟烷（在充氧空气中浓度为 2 - 3%，使用制氧机 EverFlo）维持麻醉状态。

使用动物体温控制器结合小型啮齿动物直肠温度探头和一个内置热电阻传感器的小型加热垫（15×10 厘米）以及一个额外的硅胶垫来确保最大程度的热传递，监测并控制动物体温在 37.5°C。为使镇痛处理生效，让动物在稳定的麻醉状态下保持 15 分钟以上，同时用 0.9%（w/v）的生理氯化钠溶液（生理盐水）保持眼睛湿润。随后，使用 2.5% 的去氧肾上腺素（，溶于 PBS，pH 调至 7.0）和 1%（w/v）的阿托品（溶于 PBS，pH 调至 7.0）使瞳孔充分扩张，此后用 1% 甲基纤维素的生理盐水溶液保持眼睛湿润。

视网膜电图（ERG）电极是定制的，使用直径 200 微米的无涂层金线绕成直径 3 毫米的环，然后轻轻放置在动物的眼睛上。一根缠绕在动物尾巴上的不锈钢丝作为接地电极。所有信号通过 0.1 - 300Hz 的带通滤波器进行滤波，并使用 Open - Ephys 系统与基于 Intan RHD2132 集成细胞外放大器电路的前置放大器以 30kHz 的频率进行采样。

动物的左眼用一块不透光的黑色聚氯乙烯（PVC）覆盖，并从右侧用铝箔进一步遮挡。动物的右侧用一个切成两半的乒乓球进行刺激，并用一个白色发光二极管（欧司朗 Oslon LUWCN7N）照明，该发光二极管由定制的恒流源控制。通过这种方式，进行暗适应和明适应（3 勒克斯背景照明）测量，每个条件下展示 32 次闪光（每次闪光持续时间 40 - 180 微秒），频率为 1Hz，设置三种不同的光强度。使用手持式照度计（Iso - Tech ILM1335）测量光强度（65 勒克斯、225 勒克斯、420 勒克斯），并使用以下关系式计算相应的每杆每秒对数（log rod⁻¹ s⁻¹）值：1 明适应勒克斯 = 650 光异构化（）每杆每秒。

每个条件下采集的 32 个响应进行平均，然后使用定制的 Python 2.7 脚本对数据集进行进一步分析。

07、发声测试

在正常的动物照料过程中，我们发现 HAB 小鼠如果被提起尾巴（例如在更换笼子时），尤其是当它们从网格笼顶部滑落时，有很强的在可听范围内发声的倾向。尽管之前有人尝试标准化这种笼 - 网格发声测试，但在我们的研究中采用了悬尾测试（TST），这是一种通常用于评估小鼠抑郁样行为的行为测试。

对于该测试，使用热灭菌胶带将动物在尾巴根部上方约 2 厘米处固定在一根直径 5 毫米的垂直不锈钢杆上（离地面 20 厘米）。也可以使用其他胶带，但发现这种材料的特点是对鼠皮的粘附性较低，并且去除时不会引起皮肤刺激。测试在一个隔音室内进行。测试持续时间为 5 分钟，使用高质量的可听声 / 超声波记录设备（Avisoft UltraSoundGate USG116 - 200，电容式麦克风 CM16/CMPA）监测动物的发声。离线分析使用定制编写的 Python 2.7 脚本进行。

08、标准实验室程序与分析

立体定位植入与病毒注射

所有立体定位手术程序操作相似，在此简要描述。如有必要，将提供插管植入和病毒注射的具体细节。手术前，对动物称重，并在进行其他任何操作前 15 分钟给予镇痛处理（200 毫克 / 千克 Vetalgin，溶于生理盐水，皮下注射）。在此期间，所有手术器械均进行热灭菌并用 70% 乙醇擦拭。然后将动物转移至麻醉诱导箱，用异氟烷（在充氧空气中浓度为 0 - 4%，EverFlo 制氧机）缓慢麻醉。眼睑反射和缩爪反射消失表明达到手术麻醉耐受程度，将动物转移至立体定位框架（徕卡生物系统，AngleTwo），使用无破裂 / 无创伤耳棒和口鼻夹固定。使用 2 - 2.5% 的异氟烷维持麻醉，同时使用啮齿动物直肠探头、加热毯和动物体温控制器持续监测并控制动物体温在 37.5°C。使用眼膏（Bepanthen® 眼鼻膏）保持眼睛湿润。

进一步地，使用锯齿剪刀或电动剃须刀给动物头部剃毛。用浸有利多卡因（Sigma#L7757，10%（w/v）溶于 70% 乙醇）的棉签去除多余的毛发，这还能起到额外的皮肤镇痛效果。使用锋利的剪刀，从颅骨上的枕骨隆突后 1 毫米至前囟前 2 毫米处切开皮肤。用浸有利多卡因溶液的干净棉签去除骨膜，随后使用 3% 过氧化氢。

现在，使用一个小而硬的探头，利用前囟和枕骨隆突的位置对 Angle Two 系统进行校准，如有必要，使用小鼠颅骨适配器燕尾导轨的制造公差，将内侧 - 外侧（ML）和背腹侧（DV）偏差校正至小于 50 微米。为了校正颅骨旋转，以颅骨表面上两个对侧坐标（ML 2.0 毫米，AP - 1.82 毫米）为目标，并记录相应的 DV 坐标。如果发现偏差大于 50 微米，则松开耳棒并校正初始旋转。一旦颅骨位置足够精确，就进行植入或病毒注射操作。

完成这些操作后，对动物称重，并在接下来连续 5 天每天评估和记录它们的总体健康和愈合状态，此外，动物接受术后镇痛处理（1 毫克 / 千克美洛昔康，溶于生理盐水，皮下注射，每天一次）。

对于病毒注射，使用一支 5 微升的汉密尔顿注射器（7634 - 01/00），配备一个钝头 33 号针头，或一支 10 微升的 WPI 公司注射器（NANOFIL），配备一个 34 号斜面针头（NF34BV - 2），并结合电动微量泵和相应的微量泵控制器，注射速度设定为 80 纳升 / 分钟。对于涉及对 LAB 小鼠上丘（SC）进行药物遗传学操作的实验，注射 350 纳升的腺相关病毒血清型 - 5（AAV），其表达激活型 DREADD（AAV5 - CaMKII - hM3Dq - mCherry，#AV6333，N = 12）或仅表达报告荧光团（对照组，AAV5 - CaMKII - mCherry，#AV4809c，N = 12），注射坐标为（ML 0.9 毫米，AP - 3.64 毫米，DV - 1.75 毫米）。所有病毒均购自北卡罗来纳大学教堂山分校基因治疗中心载体核心实验室，使用 350 毫摩尔氯化钠溶液稀释，以达到 1.7×10¹² 病毒基因组 / 毫升的目标滴度。

注射时，首先在颅骨表面用铅笔标记目标钻孔位置，使用直径 0.5 毫米的钻头以逆时针同心运动穿透颅骨，直到完整的硬脑膜可见。使用皮下注射针，将其最前端的尖锐部分轻轻弯曲到一个抛光的不锈钢表面上，形成一个微型钩状工具，首先用于去除残留的颅骨碎片，其次用于打开注射部位的硬脑膜。将注射针缓慢下降至目标位置，开始注射。注射后，将针头提升 100 微米并停留 10 分钟，以便病毒扩散。随后，移除针头，并在对侧重复该操作。注射过程中，使用生理盐水保持伤口湿润，以防止脑组织粘在针头上，并有助于后续的皮肤缝合。注射完成后，使用可吸收的无菌外科缝合材料（VetSuture fast PGLA 5/0，13 毫米反切针 3/8），用 4 - 6 个间断缝合关闭伤口，并使用碘溶液（BRAUNOL®）处理。病毒达到稳定表达的孵育时间大于 5 周。

09、引导套管植入与局部蝇蕈醇注射

为了在 HAB 小鼠（N = 14）的外侧中脑导水管周围灰质（lPAG）内局部注射蝇蕈醇，使用 25° 角，在 ML 1.02mm、AP - 4.25mm 和 DV - 1.55mm 处植入两根 3.0mm 长的 26 号引导套管。由于内部注射针长度为 4.0mm，最终注射位点为 ML 0.6mm、AP - 4.25mm 和 DV - 2.45mm。在海马上方每侧半球各放置一个颅骨螺钉（ML 1.5，AP - 1.27），以便使用牙科水泥将套管机械稳定地固定在颅骨上。使用碘溶液（BRAUNOL®）对伤口进行消毒。植入后，将长度为 3.5mm 带有防尘帽的假注射针插入引导套管，以防止堵塞。手术后，让动物恢复 2 周以上。

在高架十字迷宫（EPM）和发声任务前，对麻醉（2 - 2.5% 异氟烷）的动物进行蝇蕈醇（MUSC）、荧光标记的蝇蕈醇（fMUSC）或溶媒（人工脑脊液，aCSF）的注射。使用超微量泵进行注射，注射速度设定为 100nl/min，注射体积为 100nl。注射 45 分钟后，使动物接受行为范式测试。

10、组织学

为了从组织学上验证注射和植入位点，使用氯胺酮（50mg/kg和盐酸赛拉嗪（5mg/kg）的混合液对动物进行深度麻醉（全身注射，每 10g 体重 100μl，腹腔注射）。随后，给予动物过量异氟烷诱导呼吸停止（最终麻醉），并经心脏灌注冷生理盐水，接着灌注 4%（w/v）多聚甲醛（PFA）的磷酸盐缓冲液（PBS，最终浓度以 mM 计：136.89 NaCl，2.68 KCl，10 Na₂HPO₄，1.76 KH₂PO₄；用 HCl 将 pH 调至 7.4）。动物的大脑在 4°C 下于 PFA 溶液中后固定超过 24 小时。为防止移除时植入轨迹塌陷，将动物的整个头部后固定超过 48 小时。

为了增加组织硬度以进行冷冻保护，将大脑进一步置于 30%（w/v）蔗糖的 PBS 溶液中，在 4°C 下放置超过 36 小时。随后，将大脑吸干，握住延髓，反复浸入干冰上的冷 2 - 甲基丁烷中小心冷冻，并储存在 - 80°C。使用冰冻切片机制备 35μm 厚的冠状组织切片，分几个系列进行。切片直接收集在显微镜载玻片上。

对于蛋白质荧光团，使用含有细胞核复染剂 4’,6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚（DAPI）的抗荧光衰减封片剂（VECTASHIELD® HardSet H - 1500，英国 VECTOR 实验室）覆盖并保存样本。一些系列的切片使用标准尼氏染色法进行染色，以显示大体解剖结构。简而言之，样本依次用（体积比）80%、90%、2 次 100% 乙醇脱水（每步 30 秒），在含有 300μl 冰醋酸酸化的 0.1%（w/v）甲苯胺蓝溶液中染色 30 秒。随后，样本在 100% 异丙醇中分化 30 秒，接着在 100% 二甲苯中处理超过 5 分钟。用 DPX 封片剂覆盖并保存甲苯胺蓝染色的切片。

为制备视网膜切片，取出灌注后动物的眼睛，保存在 4°C 的 4% PFA 中，并分离出视网膜。使用冰冻切片机制备视网膜切片（30μm），样本用苏木精和伊红染色。

11、Pde6brd1 基因分型

Pde6brd1 基因分型按照 Chang 等人 2013 年的方法进行。简而言之，从尾巴活检组织（B6、CD1、HAB、NAB、LAB，每个品系 N = 4）中提取基因组 DNA，向每个样本（每个 1.5mL 反应管）中加入 100μl 50mM 氢氧化钠水溶液，然后在 99°C 下孵育 30 分钟。随后，让样本冷却，每个样本加入 30μl 1M Tris - HCl 水溶液。最后，充分涡旋样本，通过短暂离心去除细胞碎片，样本储存在 - 20°C。

对于聚合酶链反应（PCR），将 2.5μl PCR 缓冲液（赛默飞世尔科技，ThermoPrime Taq 10x 缓冲液）、2.5μl MgCl₂（25mM）、1μl 脱氧核苷三磷酸（dNTP，10mM）混合液、1μl 溶解的 G1 引物、1μl G2 引物、1μl XMV 引物、0.2μl Taq DNA 聚合酶和 14.8μl 双蒸水与 1μl 基因组 DNA 溶液混合。引物序列如下：G1（5’ - CCTGCATGTGAACCCAGTATTCTATC - 3’），G2（5’ - CTACAGCCCCTCTCCAAGGTTTATAG - 3’）和 XMV（5’ - AAGCTAGCTGCAGTAACGCCATTT - 3’）。这种三引物设计的原理是，G1 和 G2 从正常非突变动物中产生 240 碱基对（bp）的 PCR 产物，而 G2 和 XMV 从 rd1 突变等位基因中产生更大的（560bp）产物。

热循环仪 PCR 方案包括以下步骤：95°C 变性 3 分钟，随后进行 34 个循环，每个循环包括退火（30 秒，55°C）和延伸（1 分钟，72°C），最后在 72°C 下进行 5 分钟的最终循环，随后在 4°C 下孵育。使用琼脂糖凝胶电泳和随后的溴化乙锭染色分析扩增的 DNA。

12、锰增强磁共振成像（MEMRI）

在扫描程序前，连续八天（8×30/24 小时）给动物（HAB 组 N = 31，NAB 组 N = 26，LAB 组 N = 30）腹腔注射低剂量氯化锰（30mg/kg，溶于生理盐水），详见 科学家 2010 年的研究。MRI 实验在 7T MRI 扫描仪上进行，在最后一次注射 24 小时后，用异氟烷（在充氧空气中浓度为 1.5 - 1.7%）麻醉动物。监测动物体温并保持在 34 - 36°C 范围内。使用鞍形接收线圈采集信号。

使用三维梯度回波脉冲序列（重复时间 TR = 50ms，回波时间 TE = 3.2ms）采集 T1 加权图像，矩阵为 128×128×128，视野为 16×16×18mm³，最终分辨率为 125×125×140.6μm³，采集 10 次平均。此外，使用快速采集弛豫增强（RARE）脉冲序列（TR = 1s，TE = 10ms）采集三维 T2 加权图像，空间分辨率与上述相同，采集 2 次平均。每只动物的总成像时间约为 2 小时。

使用统计参数映射软件包 SPM5（使用 spm 小鼠工具箱）和 SPM8（使用新的分割选项进行偏差校正，网址：www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/）对重建图像进行进一步分析。

利用小鼠特定组织概率图对所有动物采集的图像进行分割，得到偏差校正图像。然后，分几个步骤对图像进行空间归一化：1. 将所有图像（包括大脑和颅外组织）归一化到一个代表性的单只动物图像，并计算平均归一化图像。2. 在平均归一化图像上创建大脑掩模。使用反向变换的平均大脑掩模在原始空间中提取大脑。3. 将提取的大脑图像归一化到组模板。最后，使用八倍图像分辨率的高斯核平滑图像。

在 SPM 中使用全因子设计进一步分析数据，设置三个条件（HAB、NAB 和 LAB），进行全局均值校正和使用协方差分析（ANCOVA）进行全局归一化。HAB 与 NAB 以及 LAB 与 NAB 之间基于体素的两两比较（错误发现率 FDR p <0.001，聚类范围> 20）揭示了锰积累的差异。

六、统计分析

所有数据以平均值 ± 标准误（SEM）表示。使用 GraphPad Prism 7 进行统计分析。采用单因素方差分析（在某些情况下用于重复测量），随后进行 Bonferroni 事后分析。对于重复测量数据，采用双向方差分析（ANOVA），即重复测量双向方差分析（rmANOVA），随后进行 Bonferroni 事后分析。非参数分析使用 Mann - Whitney U 检验。如果列联表足够大，则使用卡方检验进行分析，否则使用 Fisher 精确检验。p < 0.05 被认为具有统计学意义。首先，通过方差分析验证组间差异，然后在适当情况下进行事后检验，比较 HAB 与 NAB 或 LAB 与 NAB 之间的差异。由于通过选择性育种产生的高焦虑和低焦虑表型的表现很可能涉及不同的复杂多基因变化，直接比较 HAB 与 LAB 是不合适的。因此，我们仅将 HAB 和 LAB 与共同的 NAB 对照组进行比较。

补充图

补充图二

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