来源：高效载药技术与先进递药系统

细菌感染是食品和医药领域最严重的风险之一，导致全球近三分之一的死亡，并对公共卫生和经济构成严重威胁。抗生素作为一种被广泛接受的治疗药物，被广泛用于治疗细菌感染。然而，滥用抗生素导致了许多耐药细菌的出现。因此，迫切需要开发有效的替代策略来治疗细菌感染，且不会导致多重耐药性。

近年来，出现了光动力疗法、化学动力学疗法和光热疗法(PTT)等多种方法来对抗细菌。其中，PTT可以通过物理加热有效地杀灭细菌，由于其突出的高选择性、非侵入性、较好的可控性、无耐药性以及不会引起全身毒性而受到人们的极大关注。在PTT过程中，在光热剂(PTA)的帮助下，近红外（NIR）光能可以转化为热能，提供时空热效应，杀灭光照射区域的细菌。

PTA种类繁多，聚多巴胺（PDA）是最有潜力的一种，它是一种以黑色素为基础的生物聚合物，广泛分布于几乎所有生物中，具有优异的生物相容性和生物降解性、良好的光稳定性和易于合成的特点。但是，PDA纳米PTA存在易聚集、NIR区域的非辐射转换和光吸收不足两个固有缺陷，严重阻碍了其临床应用。为了获得高效的光热性能，人们在两个方面做了很多努力，包括将PDA引入基质来促进PDA的分散，以及改善非辐射能量传递来增加PDA在NIR区域的光吸收能力。例如，Qi等证明，当将PDA引入琼脂糖水凝胶支架时，可以实现PDA的高PTT效率。此外，Cheng等发现，通过原位沉积将金属纳米颗粒修饰在PDA表面，PDA的光吸收效率得到提高。这是因为金属有利于提高PDA体系的电荷转移效率。受这些结果的启发，Li等推测，将表面修饰与合适的载体相结合可以提高PDA的光热性能。

Li设计了一种由阳离子聚乙烯亚胺(水溶性聚合物)、阴离子果胶(食品和医药用植物多糖)和PDA@Cu纳米粒组成的聚电解质复合水凝胶，用于抗菌治疗。通过在PDA纳米粒表面还原沉积铜离子制备了PDA@Cu纳米粒。随后，将PDA@Cu纳米粒引入到聚电解质水凝胶前驱体(CPAP)中，通过一步混合法制备了CPAP/PDA@Cu水凝胶。在CPAP的帮助下，PDA@Cu纳米粒均匀分散，无团聚；此外，CPAP基质中含有丰富的官能团，可以通过疏水作用、范德华力和静电相互作用非选择性地捕获和杀灭细菌，从而具有额外的抗菌活性。体外抗菌实验表明，CPAP/PDA@Cu对金黄色葡萄球菌(98.2%)和大肠埃希菌(100%)具有广谱抗菌活性。

该文章“Architecting polyelectrolyte hydrogels with Cu-assisted polydopamine nanoparticles for photothermal antibacterial therapy”于2022年发表在Materials Today Bio杂志上。

实验部分

方案1 CPAP/PDA@Cu水凝胶的制备(A)和抗菌应用(B)示意图。

01

PDA@Cu纳米粒的合成与表征

图S1 PDA@Cu和PDA NPs的Zeta电位（n=3）。

图1 PDA@CuNPs的表征。PDA NPs(A)和PDA@Cu NPs(B)的透射电子显微镜照片。PDA NPs(C)和PDA@Cu NPs(D)的扫描电子显微镜照片。(E)PDA@Cu NPs的扫描电子显微镜元素图谱照片。(F)PDA和PDA@Cu NPs的UV-Vis-NIR吸收光谱。(G)驱动力、温度和冷却时间的曲线拟合。(H)时间与-Lnθ的关系。(I)在不同功率(2.0、1.0和0.5W/cm2)的近红外照射下，PDA@Cu NPs的光热温升。(J)在2.0W/cm2、808nm近红外重复激光开关下，PDA@Cu的光热稳定性。(K)测试样品在不同功率的近红外辐射(2.0、1.0和0.5W/cm2)下的红外热成像。

如图S1所示，PDA NPs和PDA@Cu NPs的Zeta电位分别为-50.1mV和-10.5mV。这是因为当Cu2+被还原为Cu时，一定数量的带负电荷的PDA被消耗。因此，PDA@Cu NPs的Zeta电位增加。然后，用透射电子显微镜和扫描电子显微镜观察了所制备的PDA和PDA@Cu NPs的形貌(图1A-D)。铜纳米粒(平均直径约30nm)均匀分散在PDA表面，铜修饰后的PDA纳米粒子呈相对均匀的球形结构（平均直径约为220nm）。此外，扫描电子显微镜辅助的元素图谱图像证明了铜、氧、氮和碳元素的均匀分布，这表明成功地制备了PDA@Cu NPs(图1E)。接下来，对所制备的纳米材料的UV-vis-NIR吸收光谱进行了检测。从图1F可以看出，PDA@Cu NPs在808nm处有明显更高的吸收，这表明PDA@Cu NPs可能更适合于PTT。正如预期的那样，PDA和PDA@Cu NPs在808nmNIR的光热转换效率[PCE(η)]分别为30.8%和54.2%(图1G-H)。这一数据表明，铜沉积后，PDA纳米粒的光热性能显著增强。

其次，研究了不同功率(0.5、1.0和2.0W/cm2)下PDA@Cu NPs的光热性能。我们从图1I中观察到，在808nm，0.5W/cm2的近红外光照射下，PDA@Cu NPs的温度(Δt)在3分钟内从0℃上升到10.5℃，6分钟内达到18.1℃。随着激光功率的增大，辐照6min后，PDA@Cu NPs的温度分别升高到40.2℃(1.0W/cm2)和61.9℃(2.0W/cm2)。此外，由于最高加热温度没有显著降低，PDA@Cu NPs在多次照射后保持了良好的光热稳定性(图1J)。同样，从PDA@Cu NPs的红外热像中也观察到了光热效应(图1K)。这些结果表明，所制备的PDA@Cu纳米粒子具有良好的光热性能，有望成为治疗细菌感染的光热抗菌体系。

02

CPAP/PDA@Cu水凝胶的合成与表征

图S2 (A)冷却时间与CPAP3水凝胶冷却阶段驱动力温度的负自然对数的图拟合和(B)图S2A中所示的冷却时间的线性时间数据与-Lnθ之间的关系。

图2 CPAP/PDA@Cu水凝胶的表征。CPAP/PDA@Cu水凝胶的FTIR(A)、TGA结果(B)、保水率(C)和吸水率(D)。(E)CPAP/PDA@Cu水凝胶的扫描电子显微镜图像及其高倍率图像。

聚电解质水凝胶是一种经典的交联系统，它通过正负电荷聚合物之间的多种相互作用(如静电力、氢键和疏水作用)实现快速交联，而无需使用额外的交联剂。Li等使用聚乙烯亚胺/果胶负载PDA@Cu NPs。采用一步混合法制备了CPAP/PDA@Cu三种水凝胶(CPAP1、CPAP2和CPAP3)。

首先在相同的PDA@Cu NPs浓度下测定了PDA/PDA@Cu纳米粒和CPAP/PDA@Cu水凝胶（CAPA3）在808nm处的PCE(η)，其η分别为54.2%和55.4%(图S2)。这证实了Li等的假设，即阻止PDA@Cu NPs的聚集和促进其分散有助于提高所得到的体系的光热性能。因此，选择了具有良好光热性能的CPAP3作为后续抗菌检测的模型标本。

随后，利用FTIR光谱对CPAP/PDA@Cu水凝胶的官能团进行了研究。如图2A所示，我们观察到纯CPAP水凝胶和CPAP/PDA@Cu水凝胶在大约1648、2920和3200cm-1处有糖环、C-H和O-H振动。更有趣的是，在引入PDA@Cu NPs后，CPAP水凝胶中的红移(从3224cm-1到3190cm-1)可能是由于PDA@Cu NPs与CPAP之间新形成的相互作用(静电相互作用和π-π堆积)破坏了一些先前在聚电解质基质中建立的氢键，进一步证明了PDA@Cu NPs与CPAP网络的成功融合。然后，进行热重分析以探索CPAP样品的热稳定性(图2B)。CPAP3在600℃时的剩余质量高于CPAP，证实了由于PDA@Cu NPs的存在，CPAP的热稳定性得到了改善。

然后，通过在PBS中培养制备的水凝胶直到达到平衡状态来研究水凝胶的吸水行为(图2C)。CPAP和CPAP2在平衡状态下的吸水率分别为149.1和146.5，这是由于水凝胶的交联度增加所致。Li等推测，在CPAP基质引入PDA@Cu纳米粒后，水凝胶中形成了更多的包含静电相互作用的非共价相互作用，形成了致密的水凝胶网络，阻碍了水的吸收。也就是说，与纯CPAP水凝胶相比，CPAP2中的水很难从紧密的交联水凝胶网络中逸出，如保水性试验结果所示(图2D)。其次，用扫描电子显微镜研究了CPAP/PDA@Cu水凝胶的结构信息。负载了PDA@Cu纳米粒后，CPAP/PDA@Cu水凝胶呈现出多孔的互联结构，高倍率的扫描电子显微镜图像证实了PDA@Cu纳米粒在水凝胶中以纳米粒的形式存在，这些数据证明了CPAP/PDA@Cu的成功制备。

图3 设计的CPAP/PDA@Cu水凝胶的流变性能和自愈机理。设计水凝胶的频率扫描(A)、粘度(B)和动态阶跃应变(C)测量。(D)CPAP/PDA@Cu自愈过程的图像。(E)CPAP/PDA@Cu的可能自愈机制。

通过流变学实验研究了CPAP/PDA@Cu水凝胶的力学性能。首先，制备的CPAP/PDA@Cu水凝胶的水凝胶点接近20%(图3A)。然后，对CPAP/PDA@Cu水凝胶的模数进行了研究。如图3B所示，动态频率扫描分析结果表明，当作用于水凝胶的角频率从0.1上升到10rad/s时，G'总是大于G''。此外，G'和G''均与角频率无关，说明CPAP/PDA@Cu水凝胶的弹性行为以粘性为主。随后，通过测定不同应变下的G'和G''进行了流变性恢复试验。低应变定为1%，高应变选为1000%(超过临界点约50倍)。如图3C所示，当施加高应变(1000%)时，G'低于G''，表明CPAP/PDA@Cu水凝胶网络发生了崩溃。另一方面，当使用的应变为1%时，G'值急剧增加，并立即变得大于G''，这意味着样品返回到凝胶状态。同时，G'和G''可以在三次重复间隔后完全恢复到它们的初始值而不减少，证明了CPAP/PDA@Cu显著的自我修复能力。

此外，还考察了CPAP/PDA@Cu的自愈能力。首先将柱状CPAP/PDA@Cu水凝胶物理切割成两半。然后，如图3D所示，两半水凝胶在没有任何外部干预的情况下在环境条件下放置2小时后可以重新结合成新的水凝胶，而没有明显的折断线。此外，修复后的CPAP/PDA@Cu水凝胶与未修复的CPAP/PDA@Cu水凝胶相比无明显差异。CPAP/PDA@Cu水凝胶优异的自愈性能归功于CPAP和PDA@Cu NPs的官能团可以动态缔合和解离所产生的非共价相互作用(静电力、π-π堆积和氢键)(图3E)。

03

CPAP/PDA@Cu的体外光热抗菌活性

图S3(A) 808nm激光照射下CPAP3水凝胶的红外热图像。图S4(B) CPAP3水凝胶在808nm激光照射下(1.0 W/cm2)的温升曲线。图S5(C)用PBS、CPAP、CPAP+NIR、CPAP3和CPAP3+NIR培养的金黄色葡萄球菌菌落形成单位数（n=3，*P<0.05，***P<0.001，NS为P>0.05）。图S6(D)用PBS、CPAP、CPAP+NIR、CPAP3和CPAP3+NIR培养的大肠杆菌菌落形成单位数（n=3，*P<0.05，***P<0.001，NS为P>0.05）。

图S7 不同组对金黄色葡萄球菌（A和B）和大肠杆菌（C和D）的活/死菌染色定量分析（n = 3，*P < 0.05，**P<0.01，***P<0.001，NS表示P>0.05）。

图S8 用CPAP/PDA@Cu水凝胶处理后的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的放大扫描电镜图像。

图4 不同样品的体外抗菌活性。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌经PBS、CPAP、CPAP+NIR、CPAP3和CPAP3+NIR处理后的定植(A)、共聚焦荧光(B)和扫描电子显微镜(C)图像。

首先，研究了CPAP/PDA@Cu(CPAP3)水凝胶的光热性能。我们从图S3和图S4中观察到，在808nmNIR(1.0W/cm2)照射下，凝胶温度(Δt)在3min内从0℃上升到40.1C，5min内达到45.7C。这些结果表明，所制备的CPAP/PDA@Cu水凝胶具有良好的光热性能，有望成为治疗细菌感染的光热抗菌体系。

如图4A所示，在37℃下与水凝胶接触2小时后，使用CPAP水凝胶和CPAP/PDA@Cu水凝胶处理后，金黄色葡萄球菌的存活率(图S5)分别为80.2%和34.6%；大肠杆菌的存活率(图S6)分别为71.1%和22.4%。因此，我们推测具有大的正电基团(-NH2)的CPAP/PDA@Cu水凝胶可以与负电细菌细胞膜相互作用，捕获病原体并灭活。此外，CPAP/PDA@Cu水凝胶的抗菌性能优于CPAP水凝胶，这主要归功于PDA@Cu NPs的抗菌作用。如预期的那样，在808nm近红外激光(1.0W/cm2，5min)的帮助下，CPAP/PDA@Cu水凝胶对大部分金黄色葡萄球菌(>98.2%)和几乎所有的大肠杆菌(100%)都有杀灭作用。此外，与CPAP组相比，引入近红外后的抗菌性能没有明显提高，这是由于CPAP缺乏光热升温杀菌性能所致。

随后，Li等进行了活/死细菌染色试验，以确定CPAP/PDA@Cu(CPAP3)水凝胶的潜在抗菌机制。我们发现，荧光检测和平板计数试验显示出相同的抗菌趋势。如图4B和S7所示，经PBS处理的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都显示出明显的绿色荧光，只有少数细菌被标记为红色荧光。比较而言，CPAP、CPAP+NIR、CPAP3有一定的红色荧光，而CPAP3+NIR的抗菌效果最好。

然后，用SEM表征杀菌效果，以探讨不同样品处理后金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的形态变化(图4C)。使用PBS处理的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都显示出光滑和完整的细胞膜，表明PBS对细菌的损害可以忽略不计。相比之下，水凝胶和水凝胶+近红外处理后细菌受到不同程度的破坏。更具体地说，CPAP/PDA@Cu水凝胶组出现了一些皱纹，表明CPAP/PDA@Cu水凝胶具有特定的抗菌活性。这可能是因为所配制的聚电解质水凝胶具有一些固有的抗菌性能，通过CPAP/PDA@Cu与细菌之间的有效相互作用(如静电吸附)捕获和杀灭细菌，从而促进了抗菌效果。然而，CPAP/PDA@Cu水凝胶中仍有一些形态良好的细菌，说明CPAP/PDA@Cu水凝胶的抗菌能力不足以杀灭所有细菌(图S8)。更重要的是，当CPAP/PDA@Cu在808nm近红外的辅助下使用时，细菌表现出更严重的损伤，细菌细胞膜变形甚至破裂，这表明所开发的抗菌体系(CPAP/PDA@Cu+NIR)具有最显著的杀菌效果。

04

细胞毒性和溶血试验

图S9 PBS、CPAP和CPAP3暴露1天、3天和5天后，采用CCK-8法测定对L929细胞的体外细胞毒性（n=3和NS表示P>0.05）。

图5 体外生物相容性分析。(A)PBS、DDW和CPAP/PDA@Cu的溶血试验照片。(B)在不同标本存在的情况下，大鼠红细胞的体外溶血情况(n=3)。(C)用CCK-8法检测不同标本作用1d、3d、5d后对L929细胞的体外杀伤作用(n=3)。(D)L929细胞经不同标本处理1d、3d、5d后，钙-AM和PI双染的激光共聚焦显微镜图像。

首先，通过血液相容性实验评价了CPAP/PDA@Cu水凝胶的生物相容性。去离子水(DDW)处理的红细胞上清液为鲜红色，而PBS和CPAP/PDA@Cu水凝胶处理的红细胞上清液为无色(图5A)。因此，如图5B所示，水凝胶和PBS的光密度(OD)远低于DDW组，表明CPAP/PDA@Cu水凝胶的溶血作用可以忽略不计。然后，采用CCK-8法检测CPAP/PDA@Cu水凝胶对L929细胞的细胞毒作用。如图5C和S9所示，与对照组相似，近红外处理和CPAP/PDA@Cu水凝胶对L929细胞没有明显的毒性。此外，我们还利用活/死细胞染色技术对所制备的CPAP/PDA@Cu水凝胶的细胞相容性进行了研究。当CPAP/PDA@Cu与L929细胞培养时，没有检测到明显的红色荧光，表明CPAP/PDA@Cu水凝胶的无毒性质(图5D)。此外，我们还发现所设计的CPAP/PDA@Cu(CPAP3)水凝胶具有显著的止血能力(图6A-B)。例如，样品处理3分钟后，PBS、纱布和CPAP3的血液重量分别为249.5mg、100.9mg和24.7mg。综上所述，CPAP/PDA@Cu水凝胶具有良好的生物相容性，有望用于体内抗感染治疗。

05

体内抗菌实验

图S10(A) 808 nm NIR照射（1.0 W/cm2）下PBS和水凝胶下大鼠创面部位温度升高。图S11(B) 各组不同天数的创面面积（%）评价（n=3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。

图6 CPAP/PDA@Cu水凝胶止血和光热性能的体内评估。(A)展示应用于鼠尾截肢模型后的材料的照片。(B)在大鼠尾部截肢模型中，通过测量总失血量来确定受试材料的止血能力(n=3，***P<0.001)。(C)体内伤口处理化验示意图。(D)大鼠不同时间间隔的红外热像图。

图7 伤口愈合特性的活体评估。(A)从0-12天不同处理金黄色葡萄球菌感染伤口的摄影图像。(B)从0-12天用不同样本处理的伤口收缩示意图：(1)PBS，(2)Tegaderm，(3)CPAP3和(4)CPAP3+NIR。(C)不同处理组治疗后第一天琼脂平板上细菌菌落的图像：(1)PBS，(2)Tegaderm，(3)CPAP3和(4)CPAP3+NIR。

Li等使用大鼠细菌感染模型来评估设计的CPAP/PDA@Cu敷料的体内抗菌能力(图6C)。首先，研究了CPAP/PDA@Cu水凝胶的体内光热性能。在808nmNIR(1.0W/cm2)照射3min后，CPAP/PDA@Cu水凝胶覆盖的大鼠伤口区域温度(Δt)上升到23.4℃，而PBS局部温度仅上升到1.9℃；此外，第一天采用琼脂平板菌落计数法检测伤口处的细菌，以评估不同样品的杀菌性能(图7C和S10)。如图7C所示，CPAP水凝胶和对照组的琼脂平板上出现了大量细菌。相比之下，CPAP/PDA@Cu的近红外处理的琼脂平板上几乎没有观察到细菌，这与体外抗菌数据一致，为CPAP/PDA@Cu可以作为体内抗菌治疗的强大平台提供了直观的证据。

随后，用数码相机拍摄了不同标本(PBS、Tegaderm水凝胶、CPAP/PDA@Cu水凝胶和CPAP/PDA@Cu水凝胶+NIR)处理的金黄色葡萄球菌感染伤口的愈合过程(图7A)。伤口收缩示意图如图7B所示。随着时间的推移，所有试验组的伤口大小逐渐减小。12天时，CPAP/PDA@Cu+NIR组开放创面最小(3.4%)，有新生的表皮；CPAP/PDA@Cu水凝胶、Tegaderm水凝胶和PBS组有10.2%、32.1%和38.4%的创面未愈合，有明显的瘢痕形成(图S11)。这些结果表明，与其他组比较。CPAP/PDA@Cu+NIR组具有最好的愈合效果。在PDA@Cu NPs的光热性能和CPAP水凝胶固有的抗菌活性的协同作用下，CPAP/PDA@Cu水凝胶表现出最佳的抗菌性能，有效地杀灭病原体，加速伤口愈合过程(图S12)。此外，CPAP/PDA@Cu水凝胶在伤口处提供的一些额外功能，如止血(图6A)、气体交换、吸附渗出物、物理屏障和细胞支架，也有利于促进皮肤再生。

图S12 PBS、Tegaderm、CPAP3和CPAP3+NIR（n=3，和**P<0.01）治疗后第一天伤口部位琼脂平板上菌落的定量统计。

图S13(A) 伤口中IL-6的百分比的统计学数据（n=3，*P<0.05，***P<0.001）。图S14(B) 伤口中CD31百分比的统计数据（n=3，***P<0.001）。

图8 不同样本处理后新生皮肤的组织学变化。皮肤组织切片经H&E(A和B)、Masson‘s三色(C和D)、IL-6(E)和CD31(F)荧光标记后的代表性图像。(G)制备的CPAP/PDA@Cu的潜在伤口愈合机理图。

最后，对创面愈合过程中皮肤组织的组织学变化进行研究，以更好地了解创面修复的内在机制。在不同处理(PBS、Tegaderm水凝胶、CPAP/PDA@Cu水凝胶和CPAP/PDA@Cu水凝胶+NIR)后的预定时间收集皮肤组织，并进行H&E(图8A和B)、Masson(图8C和D)、IL-6(图8E)和CD31(图8F)染色。光镜观察结果显示，第12天CPAP/PDA@Cu组创面瘢痕宽度(0.98mm)最小，与PBS组(2.33mm)、Tegaderm组(1.83mm)和CPAP3组(1.67mm)相比，高倍镜下CPAP3组和对照组创面均有大量炎症信号(中性粒细胞和血细胞)，而CPAP/PDA@Cu组创面无明显炎症反应，并有新生的真皮组织和毛囊(图8A和图B)。此外，与其他组相比，CPAP/PDA@Cu+NIR组有更多的胶原纤维(图8C和D)，CPAP/PDA@Cu+NIR组创面IL-6炎症标志物的表达明显低于其他三组(图S13)。此外，与其他三个试验组相比，近红外辅助的CPAP/PDA@Cu体系显示CD31的表达最高，这表明CPAP/PDA@Cu+NIR组具有最好的促血管生成能力(图S14)。总而言之，CPAP/PDA@Cu+NIR可促进创面从止血阶段向炎症、增殖和重塑阶段的过渡，导致再生皮肤炎症程度较低，胶原纤维含量高，肉芽较厚，并有新生毛囊(图8G)。这些数据表明，近红外辅助的CPAP/PDA@Cu系统有望成为细菌感染的光热治疗平台。

总结

综上所述，Li等首次成功开发了高性能抗菌平台(CPAP/PDA@Cu)。首先采用一步法在PDA纳米粒表面原位生长铜纳米粒，然后通过简单的混合方法将其均匀分散在CPAP水凝胶基质中，构建了PDA@Cu纳米PTA。由于CPAP水凝胶固有的细菌捕获/杀灭能力和CPAP/PDA@Cu强大的光热性能(η=55.4%)，构建了一种高效、方便、广谱、环保的抗菌体系，不仅在体外对金黄色葡萄球菌(98.2%)和大肠杆菌(100%)具有杀菌活性，而且在体内也确保了出色的高效杀菌能力。Li等的研究为PTT设计高性能PDA光热纳米材料开辟了一条新的途径。

文献来源：Li Z, You S, Mao R, et al. Architecting polyelectrolyte hydrogels with Cu-assisted polydopamine nanoparticles for photothermal antibacterial therapy [J]. Materials Today Bio, 2022, 15: 100264.