* * * * *
**输血相容性检测技术：**
* * * * *
1. ABO和Rh（D）血型鉴定
2. 交叉配血试验
3. 不规则抗体筛查
4. 新生儿溶血病血清学检测
5. IgG抗-A（B）效价测定
6. 抗球蛋白试验
7. 吸收试验
8. 放散试验
9. 输血相容性检测室内质控
* * * * *
**1.ABO和Rh（D）血型鉴定**
* * * * *
红细胞血型系统最具有临床意义的是ABO和Rh两大系统，因此目前要求对所有的患者进行ABO血型及Rh血型常规检测。在Rh系统中，D抗原的免疫原性最强，50%～75%的Rh阴性个体通过输血或妊娠，可受D抗原刺激产生抗-D，其重要性仅次于A和B抗原，所以对Rh血型只要求检测D抗原。
* * * * *
**1.1.目的** 规范ABO、Rh（D）血型鉴定操作；保证临床用血的安全性及有效性。
**1.2.职责** 输血科技术人员负责ABO和Rh（D）血型鉴定。
**1.3.适用范围** 适用于输血科ABO和Rh（D）血型鉴定血标本。
**1.4.方法原理**
**1.4.1.ABO血型：**根据红细胞上有或无A抗原或/和B抗原，进行红细胞凝集试验。正定型，是用已知抗－A和抗－B分型血清来测定红细胞上有无相应的A抗原或/和B抗原；反定型，是用已知A细胞和B细胞来测定血清中有无相应的抗－A或/和抗－B。
**1.4.2.Rh（D）血型：**用抗D血清来测定红细胞表面有无D抗原，凡带有D抗原者称为Rh（D）阳性，不带D抗原者称为Rh（D）阴性。
**1.5.所需材料和设备**
**1.5.1.材料：**微柱凝胶卡、抗-A、抗-B、抗-D试剂、A、B、O型反定型试剂红细胞、生理盐水、小试管、滴管、患者血标本。
**1.5.2.设备：**普通离心机、显微镜、血型血清学专用离心机。
**1.6.操作步骤**
**1.6.1.试管法**
1.6.1.1.将标本离心，使标本血浆/血清与红细胞分离，并吸取红细胞配制3-5％悬液（16滴生理盐水+1滴压积红细胞=5%）。
1.6.1.2.取小试管3支，分别标明抗-A、抗-B、抗-D，分别加抗-A、抗-B、抗-D试剂各1滴于试管底部，再以滴管分别加入受检者3-5%红细胞悬液1滴，混匀。
1.6.1.3.另取小试管3支，分别标明A、B、O细胞，用滴管分别加入受检者血清2滴于试管底部，再分别以滴管加入3-5%A、B、O型试剂红细胞悬液1滴，混匀。
1.6.1.4.以1000g离心力离心10s。
1.6.1.5.将试管轻轻摇动，使沉于管底的红细胞浮起，先以肉眼观察有无凝集（或溶血）现象，如肉眼凝集不明显，应将反应物倒在玻片上，再以显微镜检查。
1.6.1.6.ABO血型结果判定（见表1-1）：
**表 1-1 ABO血型结果判断**
注：　“+” 凝集；“-”不凝集
1.6.1.7.Rh（D）血型判定：红细胞与抗-D试剂凝集强度≥2+为Rh（D）阳性；凝集强度<2+需做弱D确认试验；无凝集为Rh（D）阴性；。
1.6.1.8.凝集强度判断标准：
4+ 红细胞凝集成一大块，背景清晰透明；
3+ 红细胞凝集成数小块，背景尚清晰；
2+ 红细胞凝块分散成许多小块，背景可见到游离红细胞；
1+ 肉眼可见大颗粒，周围有较多游离红细胞；
± 镜下可见数个红细胞凝集在一块，周围有许多游离红细胞；
混合外观凝集（Mixed Field，MF）是指镜下可见少数红细胞凝集，而绝大多数红细胞仍分散分布；
-阴性 镜下未见凝集，红细胞均匀分布。
**1.6.2.微柱凝胶法**
1.6.2.1.微柱凝胶试剂卡的准备：观察外观，如有干胶、杂质、气泡不可使用，之后将卡放置室温（18－25℃）平衡，再用专用离心机离心5分钟。
1.6.2.2.红细胞悬液的制备：取被检者压积红细胞10微升，加入1.0－1.2毫升红细胞稀释液，外观应为均匀淡红色，无絮状物和血块。　
1.6.2.3.取ABO和Rh系统微柱凝胶血型卡，在卡上标记患者姓名、病室床号等，将卡上的锡纸膜撕开。
1.6.2.4.将50l1%的受检者红细胞悬液加到卡上1-3孔对应的抗-A、抗-B、抗-D的微管中。　
1.6.2.5.将50l1%的反定型试剂红细胞试剂加入到4-6孔对应的A、B、O细胞微管中。再在微管中加入50l的患者血清或血浆。
1.6.2.6.即刻使用专用离心机离心5分钟（900rpm2分钟，1500rpm3分钟），取出肉眼判定结果并做好记录。
**结果评估：**
-100%的红细胞沉在微管的底部
+/- 100%的红细胞沉在微管的下端1/3之内
1+ 80%的红细胞在微管下端2/3之内
2+ 80%的红细胞在微管上端2/3之内
3+ 80%的红细胞在微管上端1/3之内
4+ 凝集的红细胞处于微管的顶部
DP 双群（双视野）细胞
H 溶血
**1.7.注意事项**
1.7.1.单克隆抗体试剂和试剂细胞（除谱细胞外）每天使用前必须与相对应的红细胞和血清作阳性、阴性对照，以检测其活性。
1.7.2.观察结果时既要看有无凝集或溶血现象，更要注意凝集强度，此有助于A、B亚型、类B或顺式（cis）AB的发现。
1.7.3.人红细胞ABO血型检验结果是根据红细胞的抗原和血清/血浆中的抗体反应结果所决定，因此正反定型的结果应该一致。正反定型起到一个互相验证和质控的作用。只有正反定型结果相符才能正确判定ABO血型。
1.7.4.反定型对ABO亚型的发现特别有帮助。原因是亚型患者红细胞上A或B抗原很弱，通过正反定型易于发现二者结果不一致，从而引起警惕。
1.7.5.如果正反定型不一致，则需进一步鉴定。可在正定型试验中增加抗-A1、抗-AB及抗-H；反定型试验中增加A2、O及自身细胞。正定型试验中的抗-AB是用来确认弱A和弱B抗原，抗-A1用来鉴定A亚型，抗-H用于鉴定亚型及孟买型；反定型试验中的A2细胞用于鉴定A2亚型，O型细胞用于鉴定是否存在ABO系统以外的同种抗体影响定型，自身对照用于鉴定是否存在自身抗体影响定型。如果是O型细胞或自身对照为阳性，则定型结果不可靠，必须进一步进行血型鉴定。
1.7.6.ABO正反定型不一致的原因：
1.7.6.1.新生儿尚未形成ABO同种抗体，所以三个月内的新生儿只要求做正定型确定ABO血型。
1.7.6.2.漏加试剂，试剂污染或失效、血标本和试剂搞错等，均可造成假阴性、假阳性结果。
1.7.6.3.器材不洁可产生假阳性结果。
1.7.6.4.分型血清效价太低，亲和力不强等均可使凝集反应强度减弱，易误定血型。
1.7.6.5.红细胞悬液过浓或过淡，导致抗原抗体比例不适当，出现前带或后带现象，易误判为假阴性。
1.7.6.6.受检者红细胞上抗原位点过少（如亚型）或抗原性减弱（见于白血病或某些恶性肿瘤）以及类B或cisAB等，均可使凝集反应强度减弱。
1.7.6.7.受检者血清蛋白紊乱（如巨球蛋白血症）或实验温度过高，常引起细胞呈缗钱状排列。
1.7.6.8.受检者血清中缺乏应有的抗-A或抗-B，如丙种球蛋白缺乏症，可引起正、反定型不符。
1.7.6.9.各种原因引起的红细胞溶血，误判为不凝集；部分溶血时，可溶性血型物质中和了相应的抗体，或者患者血清中血型物质过多，中和了相应抗体，可导致假阴性结果。
1.7.6.10.由细菌污染或遗传因素引起多凝集或全凝集往往是正反定型不符的原因。
1.7.6.11.近期曾输过异型血，使患者血液标本成为不同型别的红细胞混合物，定型时显示“混合外观凝集”现象。
1.7.6.12.嵌合体血型，体内有两群红细胞，定型时显示“混合外观凝集”现象。
1.7.6.13.获得性类B ，由于革兰阴性杆菌的作用，红细胞可获得“类B”的活性。
1.7.6.14.药物等因素，药物、右旋糖酐及静脉注射某些造影剂聚集而类似凝集。
1.7.6.15.血清中有意外抗体，如自身抗-I，常干扰定型。
1.7.6.16.老年人血清中抗体水平大幅度下降，影响反定型结果。
1.7.7.如果无法找到正反定型不一致的原因，患者又需要紧急输血，则只能给患者输注Rh(D)同型的O型红细胞（O型红细胞须正反定型相符）。
1.7.8.陈旧性血标本，红细胞要用生理盐水洗涤2至3次，配制悬液再行鉴定。
1.7.9.含有冷凝集素的患者血清，可采用37℃生理盐水洗涤3次，如果37℃还显弱凝集，再用42℃或45℃生理盐水洗涤1次，再进行血型鉴定。
1.7.10.自身免疫性温抗体产生的非特异性凝集患者，采用递增温度22℃→37℃→45℃的生理盐水洗涤红细胞后作血型鉴定，或者采用放散的方法将红细胞上吸附的抗体释放后再进行血型鉴定。
1.7.11.Rh(D)血型鉴定原则：①对受血者常规只测Rh(D)抗原，而对献血者不仅要检查Rh(D)抗原，在初筛为阴性的情况下必须进一步确定是否为弱D，即旧称Du；②Rh(D)阴性及弱D的受血者原则上应提供Rh(D)阴性血，不得使用Rh(D)阳性及弱D的血。弱D针对受血者而言为Rh(D)阴性，而对献血者而言则为Rh(D)阳性。
**1.8.相关文件**
1.8.1.《全国临床检验操作规程》
1.8.2.《临床输血技术》
**1.9.相关记录**
《血型鉴定登记本》
* * * * *
**2.交叉配血试验**
* * * * *
交叉配血试验也称配合性试验，包括2类，一是“主侧”试验，采用受血者血清与供者红细胞进行的相容性试验；二是“次侧”试验，采用供血者血清与受血者红细胞进行的相容性试验。交叉配血的目的是检测受、供者血液之间是否有不相配合的抗原、抗体成分。由于抗体包括盐水反应性抗体及非盐水反应性抗体，因此交叉配血试验中要求采用能够检测出这两种类型抗体的方法。
* * * * *
**2.1.目的：**规范交叉配血试验操作；保证临床用血的安全性及有效性。
**2.2.职责：**输血科技术人员负责交叉配血试验。
**2.3.适用范围** 适用于临床配血标本。
**2.4.方法原理**
**2.4.1.盐水法：**本法是目前最常用的配血方法，可以发现临床上最重要的ABO不配合性。当受血者血清（浆）和供血者红细胞经混合并离心后，如有ABO不配合问题，就会很快显示出来。
**2.4.2.凝聚胺法：**利用低离子介质（LIM），降低介质的离子强度，减少红细胞周围的阳离子云，以促进红细胞和血清（浆）中的抗体结合。加入凝聚胺（Polybrene）溶液后，可使红细胞产生非特异性的凝聚。最后，加入悬浮液（Resuspending）具有中和凝聚胺的作用，使正常的红细胞非特异性凝集散开，试验结果为阴性；如果红细胞被相应抗体致敏，则会被凝聚胺凝结，凝集就不会散开，试验结果为阳性。
**2.4.3.微柱凝胶法：**红细胞血型抗原与不完全抗体（IgG），在抗人球蛋白的桥梁作用下，经一定的离心力，产生特异性免疫凝集复合物或红细胞血型抗原与完全抗体（IgM）直接产生的特异性免疫凝集复合物，被排阻在具有三维空间网状结构的凝胶表层或凝胶颗粒间隙之中，判为阳性结果，表示待检血标本中含有相应红细胞血型抗原抗体；红细胞全部沉积于凝胶孔腔底部，即判断为阴性反应，表示待检血标本中无相应的红细胞血型抗原抗体。
**2.5.所需材料和设备**
**2.5.1.材料：**凝聚胺试剂盒、微柱凝胶卡、患者血标本、生理盐水、小试管、滴管、献血者血标本。
**2.5.2.设备：**普通离心机、血型血清学专用离心机、恒温水浴箱、显微镜。
**2.6.操作步骤**
**2.6.1.盐水法**
2.6.1.1.以生理盐水配制供、受者3%～5%红细胞悬液。
2.6.1.2.取试管2支，标记主、次侧，主侧加受血者血浆（血清）2滴，献血者3%～5%的红细胞悬液1滴；次侧加献血者血浆（血清）2滴，受血者3%～5%红细胞悬液1滴。
2.6.1.3.1000g离心力离心10s。
2.6.1.4.轻轻摇动试管，使沉于管底的红细胞浮起，以肉眼观察有无凝集（或溶血）现象，无凝集为配血合格，如有凝集或溶血，视为配血不合格。
**2.6.2.凝聚胺法**
2.6.2.1.将上述盐水法无凝集的试管每管各加低离子介质（LIM）溶液0.7ml，轻摇混匀。
2.6.2.2.每管各加2滴凝聚胺溶液，轻摇混匀。
2.6.2.3.1000g离心力离心10s，倾去上清液，不要沥干。
2.6.2.4.轻轻摇动试管，目测红细胞有无凝集，如无凝集，必须重做。
2.6.2.5.加入2滴重悬液，并轻轻混合，观察结果。
2.6.2.6.结果判定：如凝集散开，则为凝聚胺引起的非特异性凝集，判为阴性结果，配血相合；如凝集不散开，则为抗原抗体结合的特异性反应，判为阳性结果，配血不相合；如肉眼观察凝集强度弱，可进一步在显微镜下观察有无凝集。结果判定要求在1min内完成，最长不要超过3min，因为弱凝集的阳性结果，超过1min可能变为阴性。
**2.6.3.微柱凝胶法**
2.6.3.1.微柱凝胶试剂卡的准备：观察外观，如有干胶、杂质、气泡不可使用，之后将卡放置室温（18－25℃）平衡，再用专用离心机离心5分钟。　
2.6.3.2. 红细胞悬液的制备：取供、受者压积红细胞10微升，分别加入1.0－1.2毫升红细胞稀释液，外观应为均匀淡红色，无絮状物和血块。
2.6.3.3.在卡上标记患者姓名、病室床号及主、次侧等，将卡上的锡纸膜撕开。
2.6.3.4.在主侧孔先加入供血者0.8%红细胞悬液50l，然后加受血者血浆（血清）50l。
2.6.3.5.在次侧孔中先加入受血者0.8%红细胞悬液50l，然后加供血者血浆（血清）50l。
2.6.3.6.在孵育器内37℃条件下孵育15min。
2.6.3.7.使用专用离心机离心5分钟（900rpm2分钟，1500rpm3分钟）。
2.6.3.8.判读并记录结果。
**结果判读：**
-100%的红细胞沉在微管的底部
+/- 100%的红细胞沉在微管的下端1/3之内
1+ 80%的红细胞在微管下端2/3之内
2+ 80%的红细胞在微管上端2/3之内
3+ 80%的红细胞在微管上端1/3之内
4+ 凝集的红细胞处于微管的顶部
DP 双群（双视野）细胞
H 溶血
**结果评估：**
100%的红细胞沉在微管的底部，判为阴性结果，配血相合。
其他所有格局的结果，均为阳性结果，配血不相合。
**2.7.注意事项**
2.7.1.配血技术有：①常规配血技术：选择的技术不仅要能检查出不配合的IgM抗体，还必须能检查出尽可能多的不配合的IgG抗体，最大限度地减少抗体的漏检。目前认为盐水法交叉配血是输血前检查必不可少的试验，首先采用盐水法进行交叉配血，再采用能够检出IgG类抗体的方法进行交叉配血；②特殊配血技术，如：预温配血技术：主要用于解决无临床意义的冷抗体引起的交叉配血不配合。
2.7.2.主侧交叉配血不相合的原因：①患者或供者ABO血型定型不正确，或二者的ABO血型不配合；②患者血清中存在同种抗体，与供者红细胞上的相应抗原起反应；③患者血清中存在自身抗体，与供者红细胞中的相应抗原起反应；④供者红细胞上已经包被了抗体，导致抗球蛋白试验阳性；⑤患者血清不正常，如白蛋白/球蛋白比例不正常引起缗钱状假凝集，血清中存在高分子聚合物的血浆扩容剂引起假阳性（用盐水添加试验来解决）；⑥试验系统被污染。（详见表2-1）
2.7.3.次侧交叉配血不相合的原因：①供者血清中存在针对患者红细胞抗原的抗体；②患者与供者的ABO血型不相合；③患者红细胞已经包被了抗体，直接抗球蛋白试验阳性。
2.7.4.如果出现不明原因的凝集，需加做自身对照。
**表2-1 主侧配血不相合原因分析及解决方案**

2.7.5.交叉配血实验中，离心力、离心时间不当，可造成假阴性或假阳性结果。
2.7.6.恒温水浴箱温度不正确，可造成错误结果。
2.7.7.出现溶血或部分溶血应判为阳性结果（标本本身溶血例外）。
2.7.8.含有冷凝集素的患者交叉配血时可采用37℃生理盐水洗涤红细胞3次，如果37℃还显弱凝集，再用42℃或45℃生理盐水洗涤1次，再进行交叉配血。
2.7.9.自身免疫性温抗体产生的非特异性凝集，有时患者血清中的游离抗体很难吸收完全，导致配血困难，在排除存在同种抗体的情况下，不得已时，只能选择凝集反应弱的血液输注，输注时速度不宜过快。
**2.8.相关文件**
2.8.1.《全国临床检验操作规程》
2.8.2.《临床输血技术》
**2.9.相关记录**
《交叉配血试验报告单》
* * * * *
**3.不规则抗体筛查**
* * * * *
抗体筛查的目的是发现有临床意义的不规则抗体。不规则抗体是指抗-A、抗-B以外的血型抗体，大约有0.3%～2%的群体血清中含有同种抗体，主要由妊娠、输血后所产生。常用的试验方法有盐水介质法、低离子强度介质法（LISS）、酶技术法、抗人球蛋白法、凝聚胺法、微柱凝胶法等。
抗体筛选试验用的筛选红细胞通常是以2～3个单人份的O型红细胞组成一套筛选细胞试剂，包括以下常见的抗原：D, C, E, c, e, M, N, S, s, P, Lea, Leb, K, k, Fya, Fyb, Jka, Jkb。
* * * * *
**3.1.目的** 规范红细胞血型抗体筛选，保证临床用血的安全性及有效性。
**3.2.职责** 输血科技术人员负责红细胞血型抗体筛选、鉴定。
**3.3.适用范围** 适用于输血科抗体筛选血标本、疑难血型标本及疑难配血标本。
**3.4.试验原理**
3.4.1.用受血者的血清与特殊的试剂红细胞—筛选红细胞在不同的介质中起反应，以发现37℃中有反应活性的抗体。
**3.5.所需材料和设备**
3.5.1.材料 凝聚胺试剂盒、不规则抗体筛检卡、筛选细胞、患者血清标本、0.9%生理盐水、小试管、滴管。
3.5.2.设备 普通离心机、血型血清学专用离心机、电热恒温水浴箱、显微镜。
**3.6.操作步骤**
**3.6.1.盐水法**
3.6.1.1.取试管3支，标记为1、2、3，分别加受入血者血浆（血清）2滴；
3.6.1.2.于1、2、3号试管中分别加入3-5%浓度的筛选细胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各1滴；
3.6.1.3.1000g离心力离心10s。
3.6.1.4.轻轻摇动试管，使沉于管底的红细胞浮起，以肉眼观察有无凝集或溶血现象，无凝集为血清中不含IgM类不规则抗体，试验阴性，如有凝集或溶血，证明血清中含有IgM类不规则抗体，为试验阳性。
**3.6.2.凝聚胺法**
3.6.2.1.将上述盐水法无凝集的试管每管各加低离子介质（LIM）溶液0.7ml，混合均匀。
3.6.2.2.每管各加2滴凝聚胺溶液，混合均匀。
3.6.2.3.1000g离心力离心10s，倾去上清液，不要沥干。
3.6.2.4.轻轻摇动试管，目测红细胞有无凝集，如无凝集，必须重做。
3.6.2.5.加入2滴重悬液，并轻轻混合，观察结果。
3.6.2.6.结果判定：如凝集散开，则为凝聚胺引起的非特异性凝集，证明血清中不含IgG类不规则抗体，判为阴性结果；凝集不散开，则为抗原抗体结合的特异性反应，证明血清中含有IgG类不规则抗体，判为阳性结果；如肉眼观察凝集强度弱，可进一步在显微镜下观察有无凝集。结果判定要求在1min内完成，最长不要超过3min，因为弱凝集的阳性结果，超过1min可能变为阴性。
**3.6.3.微柱凝胶法**
3.6.3.1.将准备好的不规则抗体筛检卡做好标记。
3.6.3.2.将Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号筛选细胞用低离子溶液配成0.8-1.0%的细胞悬液。分别加入对应的微管中，每孔各一滴（或50μl）。
3.6.3.3.分别立即加入被检者血清1滴（或50μl）。
3.6.3.4.加样后的试剂卡，置37℃孵育器中孵育15分钟。
3.6.3.5.使用专用离心机离心5分钟（900rpm 2分钟，1500rpm 3分钟），取出肉眼观察结果。
3.6.3.6.结果判定：根据所提供的筛检红细胞或谱细胞的反应格局来判定结果。例：按Ⅰ(-)、Ⅱ(4+)、Ⅲ(-）的实验结果及提供如下的筛检红细胞反应格局来分析。
**筛选细胞反应格局**

阴性结果用排除法,阳性结果用可能包含法。
以前五种抗原为例：
（1）Ⅰ(-)：可排除D、C、e；
（2）Ⅱ(4+)：判断可能含有D、E、c；
（3）Ⅲ(-）：可排除D、C、c、e；
综上，可认为：此样品血清中可能含有-E
**3.7.注意事项**
3.7.1.如在试验中出现溶血现象，提示为红细胞抗原抗体阳性反应，也不排除其他原因所致溶血，故对此标本一定认真分析。
3.7.2.抗体筛选试验不一定能检出所有有临床意义的抗体，一些低频率抗原的抗体或有剂量效应的抗体可能被漏检，这时需安排抗原性更完全和特异性更强的筛选细胞作试验，或用敏感度更高的技术作检查。
**3.8.相关文件**
3.8.1.《全国临床检验操作规程》
3.8.2.《临床输血技术》
**3.9.相关记录**
《不规则抗体筛查阳性登记表》
* * * * *
**4.新生儿溶血病血清学检测**
* * * * *
新生儿溶血病是由母婴血型不合引起，可见于ABO、Rh及MN等血型系统。胎儿和新生儿红细胞被来自母亲的IgG抗体包被，并在婴儿的单核-巨噬细胞系统（网状内皮系统）受到免疫性破坏，出现溶血，表现出相应的症状。病情严重程度因个体差异、抗体类型、抗体效价等不同而异。
* * * * *
**4.1.目的** 规范新生儿溶血病血清学检查操作；查找新生儿溶血病发生的原因，协助临床进行实验室诊断及治疗；保证临床用血的安全性及有效性。
**4.2.职责** 输血科技术人员负责新生儿溶血病血清学检查。
**4.3.适用范围** 母婴血型不合引起的新生儿溶血病的血标本。
**4.4.设备与材料**
4.4.1.材料 抗-A、抗-B、抗-D定型试剂、抗人球蛋白检测卡、ABO反定型试剂红细胞、筛选细胞、生理盐水、小试管、滴管、新生儿静脉血标本。
4.4.2.设备 普通离心机、血型血清学专用离心机、电热恒温水浴箱、水浴振荡仪、显微镜。
**4.5.操作步骤**
4.5.1.血标本采集及处理
采集患儿EDTA-K抗凝血标本3～5ml，分离出血浆，配制3%～5%红细胞盐水悬液。
4.5.2.试管法做ABO正反定型、RH（D）血型、直抗试验，并记录结果。
4.5.3.查对患儿和母亲血型：患儿为O型或与妈妈同型，患儿做抗筛检测以排除其他血型系统溶血，结果阴性；若患儿血型与母亲血型冲突，则按下述步骤继续操作：
4.5.3.1.洗涤红细胞：将标本全部的红细胞移入大试管，加入至少是红细胞8倍的生理盐水洗涤红细胞4遍（每次离心后尽可能多的吸干上清液，重新加入生理盐水后要充分混匀后再离心）。
4.5.3.2.洗涤4遍后，吸尽上清液，在压积红细胞液面处标记刻度，往上在以红细胞体积2/3或同体积处再标记一个刻度（不能多于红细胞体积），加生理盐水至后一个刻度，混匀。
4.5.3.3.置56℃水浴箱中轻轻震荡1min，置于水浴箱中的试管架9min。取出后立即3400r/min离心1min并吸出上层透明红色放散液备用（不能吸到红细胞层）。
4.5.3.4.取抗人球蛋白检测卡一张，其中2孔标注患儿同型及O细胞，分别加对应红细胞1滴和患者血浆2滴做游离试验，取另外3孔标注A B O细胞，分别加对应红细胞1滴和放散液2滴做放散试验。
4.5.3.5.将以上游离及放散卡贴封口膜，37℃孵育30min，离心看结果。
4.5.3.6.根据表5-1，分析结果。
**表5-1：新生儿溶血病游离、放散试验结果判定（以A型新生儿为例）**

**4.6.相关文件**
4.6.1.《全国临床检验操作规程》
4.6.2.《临床输血技术》
**4.7.相关记录**
《新生儿溶血病试验登记表》
* * * * *
**5.IgG抗-A（B）效价检测**
* * * * *
人血清中抗-A、抗-B主要为IgM型，但是有一小部分为IgG型，在O型个体中IgG型抗-A（B）较A或B型多。由于IgG抗体能通过胎盘，导致胎儿发生溶血。妊娠时对IgG抗体效价检测，能预测新生儿溶血病的发生，从而采取早期预防。
* * * * *
**5.1.目的** 规范IgG抗-A（B）效价测定操作。
**5.2.职责** 输血科技术人员负责IgG抗-A（B）效价测定。
**5.3.适用范围** 适用于母婴血型不合的新生儿溶血病及产前检查等血标本。
**5.4.方法原理** 将被检血清经2-Me处理后作倍比稀释，加入一定量的抗原红细胞，观察凝集强度。以抗体稀释后仍能与抗原红细胞出现1个（+）凝集的试管稀释倍数之倒数定为该抗体的效价。
**5.5.所需材料和设备**
5.5.1.材料 0.8-1.0%的A、B型反定型试剂红细胞、0.2M 2-Me应用液、抗球蛋白微柱卡、待检者血标本。
5.5.2.设备 加样枪、吸头、试管、普通离心机、电热恒温水浴箱、血型血清学专用离心机。
**5.6.操作步骤**
5.6.1.取小试管1支，标注稀释倍数1:2，吸取受检者血清100μl，加2-Me应用液100μl混匀，将试管口塞紧，置37℃水浴中孵育45-60min。
5.6.2.再取小试管9支，分别标上稀释倍数1:4……1:1024，每管各加生理盐水150μl。
5.6.3.第一管加2-Me处理血清150μl，混匀后移150μl至第二管内，以此类推，作倍比稀释至第9管。
5.6.4.取抗人球蛋白微柱卡，以1：128、1:256、1:512分别标注3孔作IgG检测卡，取ABO血型鉴定卡以1:32、1:64、1:128分别标注反定型3孔作IgM对照卡，每孔加入待检抗体对应血型的0.8-1%红细胞悬液50μl，然后加入对应稀释倍数血清50μl，IgG检测卡37℃孵育15min，IgM对照卡室温放置15min。
5.6.5.使用专用离心机离心5分钟（900rpm2分钟，1500rpm3分钟）。
5.6.6.取出后肉眼观察结果，以IgG检测卡最先出现1+凝集强度稀释倍数的倒数作为最终结果，同时IgM检测结果应至少比IgG检测结果低2个滴度，方能确认实验结果可靠。
**5.7.相关文件**
5.7.1.《全国临床检验操作规程》
5.7.2.《临床输血技术》
**5.8.相关记录**
《抗A、抗B效价登记表》
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**6.抗球蛋白试验**
* * * * *
抗球蛋白试验（又称Coombs试验）分为直接抗球蛋白试验和间接抗球蛋白试验。
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**6.1.目的** 规范抗球蛋白试验操作；协助临床进行诊断及治疗。
**6.2.职责** 输血科技术人员负责抗球蛋白试验。
**6.3.适用范围** 适用于临床须进行抗球蛋白试验的各种血标本。
**6.4.方法原理**
**6.4.1.直接抗球蛋白试验：**直接把抗球蛋白加入患者的红细胞悬液中，若红细胞已被抗体致敏便出现凝集，用以检测红细胞表面结合的抗体，如新生儿溶血病和自身免疫性溶血性贫血的检查。
**6.4.2.间接抗球蛋白试验：**将已知（未知）抗原的红细胞和未知（已知）抗体的血清混合，然后加入抗球蛋白血清，若抗原抗体相对应，即出现可见的红细胞凝集。用以检测游离于血清中的抗体，亦可用已知抗原的红细胞检测血清中的相应抗体效价，输血前的交叉配血或不相容输血后的抗体测定。
**6.5.所需材料和设备**
**6.5.1.材料** 抗球蛋白试剂、IgG抗-D试剂、AB型血清、3%Rh（D）阳性红细胞悬液、患者血标本。
**6.5.2.设备** 普通离心机、血型血清学专用离心机、电热恒温水浴箱。
**6.6.操作步骤**
**6.6.1.直接抗球蛋白试验**
6.6.1.1.取受检者红细胞，以生理盐水充分洗涤3次，末次洗涤后将上清液倒尽，以滤纸将管口残余的盐水吸去，再配成3%红细胞盐水悬液。
6.6.1.2.取试管3支，分别标记好受检者、阳性对照、阴性对照。其中受检者试管中加入3%受检红细胞盐水悬液1滴，再加入抗球蛋白血清1滴，混匀。
6.6.1.3.阳性对照管 抗球蛋白血清1滴，IgG抗-D致敏的3% Rh（D）阳性红细胞盐水悬液1滴，混匀。
6.6.1.4.阴性对照管 抗球蛋白血清1滴，AB型血清致敏的正常人3% Rh（D）阳性红细胞悬液1滴，混匀。
6.6.1.5.1300g离心15s，肉眼观察有无凝集，若肉眼不见凝集，以显微镜检查，记录结果。
6.6.1.6.结果判定 如阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，受检红细胞凝集者为阳性，不凝集者为阴性。
**6.6.2.间接抗球蛋白试验**
6.6.2.1.取试管3支，标明受检、阴性对照和阳性对照。
6.6.2.2. 按表7-1将反应物加入相应试管内
**表7-1 受检者、阴性、阳性对照管加入反应物**

6.6.2.3.混匀，置37℃水浴1h，用生理盐水洗涤3次。末次洗涤后，将上清液除尽，并用滤纸将残余管口的盐水吸去。
6.6.2.4.每管各加最适稀释度抗球蛋白血清1滴，混匀。1300g离心15s，肉眼观察有无凝集，若肉眼不见凝集，以显微镜检查，记录结果。
6.6.2.5.结果判定:阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，受检管出现凝集者为阳性，受检管不出现凝集者为阴性。
**6.7.注意事项**
6.7.1.血标本采取后立即进行检测，延迟检测或中途停止可使抗体从细胞上释放。
6.7.2.抗球蛋白血清应按说明书使用最适稀释度，否则可产生前带和后带反应，而误为阴性结果。
6.7.3.红细胞洗涤应迅速，一开始洗涤就不应中途停止。受检红细胞一定要用盐水洗涤3次以上，洗涤时盐水要足量并用力冲入管底，使压积于管底的红细胞松离，以除去红细胞悬液中混杂的血清蛋白，切勿用手指堵住管口颠倒混匀，以防来自皮肤上蛋白的污染，产生假阴性结果。
6.7.4.如果需要了解在体内致敏红细胞的免疫球蛋白类型，则可分别以抗-IgG、抗-IgM或抗-C3单特异性抗球蛋白血清进行试验。
6.7.5.红细胞上吸附抗体太少，极少数自身免疫性溶血性贫血直接抗球蛋白试验可呈假阴性反应。
6.7.6.全凝集或冷凝集血液标本及含有Wharton胶的脐血标本，若洗涤不充分，血液标本中有很多网织红细胞，且抗球蛋白血清中含有抗运铁蛋白时，都可使红细胞产生凝集。
6.7.7.离心速度和时间不当可造成错误结果，应严格掌握离心速度和时间。
6.7.8.如果检查的抗体为补体依赖性，则必须加入新鲜AB型血清，抗球蛋白血清中也应含有抗-C3。
6.7.9.要做好阴阳性对照，如果对照管没有出现预期结果表示结果不可靠，可能是洗涤不充分，或者抗球蛋白试剂失效等，要仔细分析原因重新检测。
**6.8.相关文件**
6.8.1.《全国临床检验操作规程》
6.8.2.《临床输血技术》
**6.9.相关记录**
《直、间抗实验登记表》
* * * * *
**7.吸收试验**
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**7.1.目的** 规范吸收试验操作。
**7.2.职责** 输血科技术人员进行吸收实验。
**7.3.适用范围** 适用于血型抗原确证、混合抗体的分离等各种血标本检测。
**7.4.方法原理** 吸收试验是当受检细胞加入已知效价的抗血清后，若红细胞上有相应的抗原，便吸收血清中的抗体，再以已知抗原的红细胞来滴定，比较吸收前后抗血清中抗体的效价来证明受检红细胞上有无相应的抗原以及强度，间接判定受检红细胞的血型及其亚型的种类。常用于ABO亚型的鉴定，抗体鉴别、全凝集红细胞的定型以及某种原因引起红细胞血型抗原减弱的定型等。
**7.5.所需材料和设备**
**7.5.1.材料** 抗-A（人源性）、抗-B（人源性）、3%A、B型反定型试剂红细胞、患者血标本。
**7.5.2.设备** 普通离心机、血型血清学专用离心机、电热恒温水浴箱。
**7.6.操作步骤**
7.6.1.将受检红细胞用生理盐水充分洗涤3次，末次洗涤后，将盐水倒尽，制备压积红细胞。
7.6.2.取压积红细胞1份，与等量抗-A血清混合；另取1份与等量抗-B血清混合。置4℃至少1h，每10min将试管摇动1次，使红细胞充分吸收抗体。
7.6.3.1300g离心5min，上层血清即为吸收液。
7.6.4.排列小试管4排，每排5支，每管各加生理盐水0.1ml。第1、3两排第1管各加已吸收抗-A及抗-B血清0.1ml，第2、4两排第1管分别各加未吸收抗-A及抗-B血清0.1ml。然后分别作2～32倍量稀释。
7.6.5.第1、2两排每管各加3%A型红细胞盐水悬液1滴，第3、4两排每管各加3%B型红细胞盐水悬液1滴。
7.6.6.1300g离心15s，肉眼观察有无凝集，若肉眼不见凝集，以显微镜检查，记录结果。
7.6.7.结果判定：吸收后，抗-A效价较未吸收抗-A效价显著降低或消失者为A型；同理吸收后，抗-B效价较未吸收抗-B效价显著降低或消失者为B型；如吸收后抗-A及抗-B效价都显著下降者为AB型；吸收后抗-A及抗-B效价都无明显差异者为O型。
**7.7.注意事项**
7.7.1.所使用的抗-A及抗-B血清最好为人源性血清。
7.7.2.所用的抗-A及抗-B血清效价不宜过高，应先将抗血清效价稀释到32为宜。
7.7.3.红细胞经洗涤压积，盐水应尽量去尽，以免抗体被稀释。
7.7.4.吸收试验的温度，根据抗原、抗体反应的最适温度来决定。ABO系统以4℃为宜，Rh系统以37℃为宜。
**7.8.相关文件**
7.8.1.《全国临床检验操作规程》
7.8.2.《临床输血技术》
**7.9.相关记录**
《血型血清学试验报告单》
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**8.放散试验**
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放散试验常用于ABO亚型的鉴定，全凝集或多凝集红细胞的定型，类B的鉴定以及新生儿溶血病的诊断等。放散试验的方法很多，ABO血型，IgM抗体以热放散法为常用；Rh血型，IgG抗体以乙醚放散法为常用。
**8.1.目的** 规范放散试验操作。
**8.2.职责** 输血科技术人员进行放散实验。
**8.3.适用范围** 适用于被抗体包被的红细胞血标本的检测。
**8.4.方法原理** 放散试验是红细胞上的抗原与血清中的抗体在适合条件下发生凝集或致敏，这种结合是可逆的，如果改变某些物理条件，抗体又可从结合的细胞上放散出，再以相应的红细胞鉴定放散液内抗体的种类，并测定其强度。
**8.5.所需材料和设备**
**8.5.1.材料** 抗-A（人源性）、抗-B（人源性）、3%A、B型反定型试剂红细胞、患者血标本、乙醚。
**8.5.2.设备** 普通离心机、血型血清学专用离心机、水浴振荡仪。
**8.6.热放散法操作步骤**
8.6.1.将受检红细胞以大量生理盐水洗涤3次，末次洗涤后，将盐水除尽。取压积红细胞1份，与2份抗-A血清混合，另取1份压积红细胞与2份抗-B血清混合，置4℃ 1h，每隔10min将试管振摇1次，使充分混合。
8.6.2.离心去除上清液，以4℃冷盐水洗涤红细胞3～4次，倾去洗涤液留取压积红细胞。加1/2容积的生理盐水（如放散液不立刻进行检查，应以AB型血清代替生理盐水）。置水浴振荡仪56℃水浴振摇10min，使吸附在红细胞上的抗体充分放散出。
8.6.3.立刻以1300g离心1min。离心时试管套管内放温水，使试管温度尽量保持在56℃，分离得到的上清即为放散液。
8.6.4.将放散液用3%A型和B型试剂红细胞鉴定抗体，即可检出受检红细胞血型。
8.6.5.结果判定：放散液和A型红细胞凝集，与B型红细胞不凝集，被检血型为A型，反之为B型，放散液和A型与B型红细胞均凝集，被检血型为AB型，如均不凝集为O型。
**8.7. 乙醚放散法操作步骤**
8.7.1.取具有相应抗原的抗凝血，吸去血浆，加大量生理盐水，洗涤1次，离心取压积红细胞备用。
8.7.2.受检者血清2ml，加压积红细胞1ml，混匀后放在适当的温度中1h，在此期间要摇匀1～2次。
8.7.3.取出后离心，将上清液吸到另一管，鉴定上清液的抗体。
8.7.4.将红细胞用生理盐水充分洗涤3次，1300g离心5min。
8.7.5.取1体积红细胞加1体积AB型血清或生理盐水，2体积乙醚，颠倒摇匀10min。
8.7.6.1300g离心5min。
8.7.7.离心后分成三层，最上层是乙醚，中层是红细胞基质，下层是含有抗体的放散液，其色深红。
8.7.8.用清洁的吸管吸出放散液。若有混浊，可再离心一次。
8.7.9.将放散液放置37℃水浴中30min，除尽乙醚。
8.7.10.取2滴放散液，加入1滴O型试剂红细胞，37℃孵育30min。
8.7.11.用盐水充分洗涤3次后加入抗球蛋白血清1滴（详细操作参照《抗球蛋白试验》）。
8.7.12.1300g离心15s，轻轻悬浮细胞，肉眼观察凝集反应，记录结果。若肉眼不见凝集，以显微镜检查。
**8.8. 注意事项**
8.8.1.为了使放散液内含有最多的抗体，吸收血清量应加大。
8.8.2.热放散时，要严格注意温度和时间。温度过高，红细胞易溶血；温度过低，抗体从红细胞上放散不完全。
8.8.3.直接抗球蛋白试验阳性的红细胞，如新生儿溶血病患儿或自身免疫性溶血性贫血患者，经洗涤后即可做抗体释放试验。
8.8.4.放散液中抗体易变性，故应分别进行鉴定；若要保存，应将抗体放散液于选定的AB血清或牛血清白蛋白液中。
8.8.5.ABO血型抗体适合采用热放散试验；鉴定Rh抗体适合采用乙醚放散试验。
**8.9. 相关文件**
8.9.1.《全国临床检验操作规程》
8.9.2.《临床输血技术》
**8.10. 相关记录**
《血型血清学试验报告单》
* * * * *
**9.输血相容性检测室内质控**
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输血相容性检测室内质控是选择已知血浆和红细胞，标定其在不同检测介质（盐水介质、凝聚胺、抗人球蛋白以及微柱凝胶等）中的阳性及阴性检测的结果。通过每天或每批与检测标本同等的检测以证明其检测过程中影响检测结果的主要因素（试剂、设备、检测程序、人员操作等）是否符合标准限定的范围，证明检测结果是否有效的衡量标准。
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**9.1.目的** 考察检测结果是否准确和稳定。
**9.2.职责** 输血科技术人员进行输血相容性检测的室内质控操作。
**9.3.适用范围** 试管法、凝聚胺法、抗人球蛋白法、微柱凝集法
**9.4.试剂组成和检测项目**
**试剂：**抗-A、抗-B、抗-D标准血清，A、B、O型标准红细胞，抗体筛选细胞，IgG抗-D标准血清。
**检测项目：**ABO正反定型、RhD血型、抗体筛查
**9.5.检测方法**
9.5.1.试剂质控：
**表9-1 ABO和Rh（D）定型试剂质量控制**

**表 9-2 ABO和Rh（D）定型试剂的最低标准**

**9.5.2.ABO血型鉴定：**按照血清试剂反应标准反应强度，设置4+为最低检出标准，检测频次建议为工作人员每天开始检测工作前；
**9.5.3.抗体筛查：**首先对IgG抗-D血清样本进行倍比稀释，再与抗筛细胞进行检测，测出与其反应强度在±的稀释比例，按比例稀释后应用，稀释后的血浆可分装后冷冻保存。设置±为抗筛检出标准，检测频次为工作人员每天开始检测工作前。
**9.6.结果判定**
严格按照《质量控制记录表》各项内容进行填写，质控数据违反相应控制规则后，如实填写《输血相容性检测室内质控失控处理记录》并及时上报科主任，当批次的检验报告作废或停发，由实验室负责人与操作人员一同对失控情况进行分析，尽量查找可能导致失控的原因，对失控作出恰当的判断。对判断为真失控的情况，应当重做质控试验，结果为在控后，对相应的所有失控标本从新进行检测。如果经过分析，有明确证据证明为假失控时，当批次受检者的检验报告可以按照原先测定的结果发出，无须再进行重复试验。
**9.7.注意事项**
9.7.1.质控品只能用于输血相容性室内质控研究，不能作为试剂。
9.7.2.质控品虽经检测并已对其进行病毒灭活，操作中仍应按照一般血液标准使用，注意防护措施。
9.7.3.质控品最佳保存条件为2℃-8℃，使用完毕后立即放回冷藏室内。
9.7.4.使用质控品，先在室温平衡10-15min，才可进行相关检测工作，如需混匀，应避免剧烈摇动。
9.7.5.红细胞质控品出现轻微溶血后，可使用生理盐水对其进行洗涤，重新悬浮后使用。
9.7.6.质控血清如出现浑浊或有沉淀物出现时，应进行适当离心，去除杂质，将上清液移至新的容器中。
9.7.7.如发生以下情况，请严禁使用
9.7.7.1.超过有效期限的质控品；
9.7.7.2.样品管已发生泄漏；
9.7.7.3.样品管标记无法识别；
9.7.7.4.红细胞样本已发生明显细胞污染，自身凝集等现象；
9.7.7.5血浆样本已发生严重浑浊现象。
**9.8.相关文件**
9.8.1.《全国临床检验操作规程》
9.8.2.《临床输血技术》
**9.9. 相关记录**
《ABO正定型试剂质量控制记录表》
《Rh(D)定型试剂质量控制记录表》
《ABO反定型细胞质量控制记录表》
《抗体筛查质量控制记录表》
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