甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）感染多为自限性，然而IAV感染增加了继发细菌感染的易感性，而流感重症往往与继发细菌感染密切相关[1]。对1918—2009年发生的4次全球流感大流行样本的回顾性研究发现，40%～95%的死亡病例是由流感继发细菌感染所致[2]。即便有流感疫苗和抗生素，但由于IAV高突变和细菌耐药等问题，流感后的细菌感染仍较为普遍，金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus是最常见的病原体之一[2-3]。肺泡巨噬细胞（alveolar macrophages，AMs）是驻留于肺泡中具有高效吞噬活性的免疫细胞[4]。IAV感染引发的γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）高表达可造成AMs耗竭，这是导致流感继发细菌感染易感性增加的重要原因[5-6]。由于AMs耗竭，中性粒细胞和单核细胞被大量招募以应对细菌感染，广泛的效应细胞浸润和不可控的炎症反应导致了流感继发细菌感染的高致病性[7-8]。因此，抑制AMs耗竭，恢复肺部固有免疫抗菌屏障，可降低流感继发细菌感染易感性和致病性。

热毒宁注射液由栀子、青蒿和金银花3味中药组成，主要用于治疗感冒、流行性感冒、上呼吸道感染和急性支气管炎等疾病，安全性高，疗效确切[9]。已有研究报道了热毒宁注射液在体内外均具有抗IAV活性[10-12]。课题组前期完成了热毒宁注射液治疗流感的大样本临床研究，以磷酸奥司他韦为对照药物，采用随机、对照、双盲设计评价了热毒宁注射液治疗流感的有效性和安全性。结果显示，与磷酸奥司他韦相比，热毒宁注射液显著缩短流感病程，对发热、恶寒、咽痛、鼻塞等流感样症状的改善优于磷酸奥司他韦；且在研究期间未观察到严重不良反应[13]。课题组也通过实验证实，与利巴韦林相比，热毒宁注射液可更好地缓解甲型H1N1流感病毒感染所致的肺部炎症[14]。此外，有研究报道了热毒宁注射液的抗菌活性[15]，临床经验亦提示热毒宁注射液对痰黄黏稠具有一定的治疗作用[16]。然而关于热毒宁注射液能否治疗流感继发细菌感染尚无报道。

本研究以H1N1继发S. aureus感染为模型，首先在致死性和亚致死性感染模型中探究了热毒宁注射液抗H1N1继发S. aureus感染活性；而后检测了热毒宁注射液对H1N1感染所致IFN-γ高表达、AMs耗竭和效应细胞浸润的干预作用；最后探究热毒宁注射液对1型辅助性T细胞（T helper 1，Th1）/2型辅助性T细胞（T helper 2，Th2）稳态的调控作用。本研究从维持Th1/Th2稳态、抑制IFN-γ高表达所致AMs耗竭角度，探讨了热毒宁注射液抑制H1N1继发S. aureus感染所致炎症性肺损伤的药效机制，为热毒宁注射液临床应用提供参考。

1 材料

1.1动物、病毒与细菌

H1N1（A/PR/8/34）由课题组保存，在9日龄鸡胚中扩增，对ICR小鼠毒力为1.5×106LD50/mL（LD50为半数致死量）。S. aureus（G+，ATCC6538）由山东省医用抗菌材料高等学校重点实验室提供。

1.2 药品与试剂

1.3仪器

R500型小鼠麻醉机（深圳市瑞沃德生命科技股份有限公司）；5415R型冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；JXFSTPRP型样品研磨仪（上海静信实业有限公司）；DW-HL398型超低温冰箱（中科美菱低温科技股份有限公司）；Scan 300型菌落计数器（法国Interscience公司）；M2e型多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）；CFX型荧光定量PCR仪、MyCycler型PCR仪（美国Bio-Rad公司）；C6 Plus型流式细胞仪（美国BD公司）。

2方法

2.1致死性感染模型的建立及给药

将小鼠按体质量随机分为对照组、H1N1感染组、H1N1继发S. aureus感染组、磷酸奥司他韦（21.2 mg/kg，相当于临床等效剂量）组、头孢克洛（106.3 mg/kg，相当于临床等效剂量）组、热毒宁高剂量（11 mL/kg，相当于人临床等效剂量的4倍，小鼠无不良反应的最大剂量）组和热毒宁低剂量（5.5 mL/kg）组，每组6只。小鼠经异氟烷麻醉后，滴鼻感染0.2 LD50H1N1（20 μL/只），3 d后滴鼻感染1×105CFUS. aureus（20 μL/只）[17-18]；对照组滴鼻等体积的生理盐水。于感染S. aureus当天开始给药，磷酸奥司他韦组ig磷酸奥司他韦胶囊，头孢克洛组ig头孢克洛胶囊，热毒宁高、低剂量组用胰岛素注射器经尾iv热毒宁注射液，对照组和继发感染组尾iv等体积的生理盐水，1次/d，连续给药7 d。每天同一时间观察记录小鼠状态，并称定体质量，持续观察14 d。

2.2亚致死性感染模型的建立及给药

小鼠分组及感染方式同“2.1”项，S. aureus感染量降至1×103CFU（20 μL/只）[17-18]。于感染S. aureus当天开始给药，连续给药4 d。末次给药后2 h，小鼠经异氟烷麻醉，气管切开插入软质针头，细线固定，注射2 mL生理盐水，制得支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）；麻醉后脱颈椎处死，摘取肺组织称定质量，左上肺叶浸于4%多聚甲醛溶液中，剩余肺叶分装，经液氮速冻后，转移至−80 ℃冰箱，用于进一步检测；取全肺于PBS中漂洗后用于制作肺单细胞悬液。

2.3qRT-PCR检测相关基因表达

取肺组织50～100 mg，经RNA抽提试剂盒提取总RNA，经EvoM-MLV反转录试剂盒获得cDNA，用SYBR Green Premix Pro TaqHS qPCR试剂盒进行qRT-PCR检测。反应条件：95 ℃、30 s变性；95 ℃、5 s解链，60 ℃、30 s退火和延伸，共40个循环。采用2−∆∆Ct法计算各基因的表达量，以β-actin作为内参基因进行均一化处理。引物序列见表1。

2.4平板菌落计数法检测肺菌量

取100 µL BALF均匀涂布在直径10 cm的固体培养基表面，置37 ℃恒温培养箱18 h，菌落计数仪测量菌落数量。

2.5ELISA检测肺组织CXCL-1、MCP-1、TNF-α、IFN-γ及BALF中MPO-DNA、NE-DNA水平

每10 mg肺组织加100 μL PBS研磨，离心后取上清，采用BCA法测定蛋白浓度，按照ELISA试剂盒说明书检测上清中CXCL-1、MCP-1、TNF-α和IFN-γ水平。BALF离心取上清，按照ELISA试剂盒说明书检测MPO-DNA和NE-DNA水平。

2.6 流式细胞术检测AMs、中性粒细胞和单核细胞比例

将肺置于300目筛网上，滴加RIPM 1640完全培养液研磨过筛，吸取细胞悬液挤压过300目滤网重复3次；用染色缓冲液（含2%胎牛血清的PBS）洗涤2次，裂解红细胞后，用染色缓冲液洗涤后过400目筛，即得肺单细胞悬液[19-20]。调整细胞浓度为5×106个/mL，取100 µL肺单细胞悬液，加入FC Block封闭液4 ℃避光封闭20 min，随后加入F4/80-PE、CD11b-FITC、CD11c-APC抗体，4 ℃避光孵育30 min，染色缓冲液清洗2次，采用流式细胞仪检测AMs（F4/80+CD11b−CD11c+）比例[5,21]。肺单细胞悬液经FC Block封闭液封闭后，加入CD45-PerCp-Cy5.5、CD11b-FITC、Ly-6G-PE、Ly-6C-APC抗体，4 ℃避光孵育30 min，染色缓冲液清洗2次，采用流式细胞仪检测中性粒细胞（CD45+CD11b+Ly-6G+）和单核细胞（CD45+Ly-6G−CD11b+Ly-6C+）比例[22-24]。

2.7 流式细胞术检测外周血Th1/Th2细胞比例

小鼠末次给药2 h后，摘眼球取血，肝素抗凝。采用小鼠外周血淋巴细胞分离液试剂盒获取小鼠外周血单个核细胞，根据文献报道的方法[25]，采用流式细胞术检测外周血Th1（CD4+IFN-γ+）/Th2（CD4+IL-4+）细胞比例。

2.8 肺组织病理变化观察

对小鼠左上肺叶进行石蜡包埋、切片，常规苏木素-伊红（HE）染色，在显微镜下观察并拍照。

2.9 统计学分析

数据采用SPSS 25软件进行统计分析，结果以表示。通过Kaplan-Meier生存分析比较组间死亡率差异；组间多重比较采用单因素方差分析（ANOVA）并通过Bonferroni法进行校正。

3 结果

3.1 热毒宁注射液可降低致死性H1N1继发S. aureus感染小鼠死亡率

如图1-A所示，仅H1N1感染未造成小鼠死亡，而继发S. aureus（1×105CFU/只）感染后第6天，小鼠全部死亡。热毒宁注射液高剂量组小鼠在继发感染后第6天开始出现死亡。与继发感染组相比，热毒宁注射液高剂量组生存率显著提高（P＜0.01，生存率为50%），且与磷酸奥司他韦组（生存率为66.7%）和头孢克洛组（生存率为33.3%）无差异。热毒宁注射液低剂量组生存率为16.7%，与继发感染组无差异。表明高剂量的热毒宁注射液对致死性H1N1继发S. aureus感染具有保护作用，可显著降低小鼠死亡率，延长生存时间。

3.2热毒宁注射液可降低亚致死性H1N1继发S. aureus感染小鼠肺病毒量和肺菌量

如图1-B所示，仅H1N1感染未导致小鼠体质量显著下降，而继发S. aureus（1×103CFU/只）感染后1 d，小鼠体质量出现显著下降（P＜0.01）。在继发感染后第2～4天，热毒宁注射液高、低剂量组小鼠体质量下降均得到控制（P＜0.01、0.001）；且在继发感染后第4天热毒宁注射液高剂量组优于头孢克洛组（P＜0.01）。如图1-C所示，继发感染后第4天，与对照组相比，H1N1感染组肺指数升高（P＜0.001），继发S. aureus感染可进一步升高肺指数（P＜0.001）。与继发感染组相比，热毒宁注射液高剂量组肺指数显著降低（P＜0.001），且低于头孢克洛组（P＜0.01），与磷酸奥司他韦组无差异。热毒宁注射液低剂量组肺指数与继发感染组无差异。

肺病毒量检测显示（图1-D），与H1N1感染组相比，继发S. aureus感染导致肺病毒量进一步增加（P＜0.001）。与继发感染组相比，热毒宁注射液高、低剂量组肺病毒量均显著降低（P＜0.05、0.001）；且热毒宁注射液高剂量组肺病毒量低于头孢克洛组（P＜0.05），但仍高于磷酸奥司他韦组（P＜0.001）。肺菌量检测显示（图1-E），对照组、H1N1感染组和头孢克洛组均具有极低且相近的肺菌量。与继发感染组相比，热毒宁注射液高、低剂量组肺菌量均显著下降（P＜0.05、0.001），但仍高于头孢克洛组（P＜0.001）。

肺组织病理学检测显示（图1-F），对照组肺泡结构清晰，未见炎性细胞浸润。H1N1感染组出现少量中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞浸润；继发感染组肺泡结构消失，中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞显著增多，并伴有出血；与继发感染组相比，热毒宁注射液高剂量组肺泡形态结构改善，中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞浸润减少；热毒宁注射液低剂量组肺部形态较继发感染组略有改善，但仍有大量效应细胞浸润。

3.3热毒宁注射液可抑制IFN-γ表达，恢复AMs比例

流感病毒感染引发的IFN-γ高表达导致了AMs耗竭[19]，因此本研究检测了热毒宁注射液对IFN-γ表达的影响。如图2-A、B所示，与对照组相比，H1N1感染可显著上调IFN-γ表达（P＜0.001），继发S. aureus感染加剧了这一过程（P＜0.001）。与继发感染组相比，热毒宁注射液高、低剂量组IFN-γ表达均显著降低（P＜0.05、0.001）；且热毒宁注射液高剂量组IFN-γ水平低于头孢克洛组（P＜0.05、0.01），与磷酸奥司他韦组无差异。流式细胞术检测了肺单细胞悬液中AMs比例，结果如图2-C、D所示，与对照组相比，H1N1感染组AMs比例降低（P＜0.001），而继发S. aureus感染进一步降低了AMs比例（P＜0.001）。与继发感染组相比，热毒宁注射液高、低剂量组AMs比例显著提升（P＜0.05、0.001），且热毒宁注射液高剂量组优于磷酸奥司他韦组和头孢克洛组（P＜0.05、0.001）。

3.4热毒宁注射液可减少中性粒细胞和单核细胞浸润，抑制TNF-α和中性粒细胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NETs）释放

AMs耗竭引发大量效应细胞被募集以应对细菌感染[19]。如图3所示，与对照组相比，H1N1感染组肺部趋化因子CXCL-1和MCP-1 mRNA和蛋白表达水平显著升高（P＜0.05、0.01、0.001）；继发S. aureus感染可加剧这一过程（P＜0.001）。与继发感染组相比，热毒宁注射液高、低剂量组CXCL-1 mRNA和蛋白表达水平显著降低（P＜0.05、0.01、0.001），热毒宁注射液高剂量组MCP-1 mRNA和蛋白表达水平显著降低（P＜0.001），热毒宁注射液低剂量组MCP-1 mRNA表达水平显著降低（P＜0.05）；且热毒宁注射液高剂量组CXCL-1和MCP-1 mRNA和蛋白表达水平显著低于头孢克洛组（P＜0.05、0.01）。

采用流式细胞术检测了肺单细胞悬液中中性粒细胞和单核细胞比例。结果如图4所示，与对照组相比，H1N1感染引发了中性粒细胞和单核细胞浸润（P＜0.001）；继发S. aureus感染可加剧这一过程（P＜0.001）。与继发感染组相比，热毒宁注射液高、低剂量组中性粒细胞和单核细胞浸润显著减少（P＜0.001）；且与磷酸奥司他韦和头孢克洛组相比，热毒宁注射液高剂量组显著抑制中性粒细胞和单核细胞浸润（P＜0.05、0.001）。

如图5-A、B所示，与对照组相比，H1N1感染可上调肺组织TNF-α表达（P＜0.05、0.001），继发S. aureus感染进一步促进了TNF-α高表达（P＜0.01、0.001）。与继发感染组相比，热毒宁注射液高剂量组TNF-α表达显著降低（P＜0.01、0.001），且低于头孢克洛组（P＜0.01）。BALF中NETs标志物检测结果如图5-C、D所示，仅H1N1感染即可引发NETs释放，MPO-DNA和NE-DNA水平显著升高（P＜0.01、0.001）；继发S. aureus感染可使MPO-DNA和NE-DNA水平进一步增加（P＜0.001）。与继发感染组相比，热毒宁注射液高、低剂量组BALF中MPO-DNA和NE-DNA水平均显著下降（P＜0.05、0.001）；且热毒宁注射液高剂量组MPO-DNA水平与头孢克洛组无差异，NE-DNA水平显著低于头孢克洛组（P＜0.01）。

3.5 热毒宁注射液可抑制过激的Th1型免疫反应

CD4+Th1型细胞是病原体感染后固有免疫应答阶段IFN-γ产生的重要途径之一[26]。流式细胞术检测外周血Th1/Th2比例，结果如图6所示，仅H1N1感染即可引发Th1型免疫极化（P＜0.01）。继发S. aureus感染进一步加剧了这一过程（P＜0.001），Th1/Th2比值较H1N1感染组提升约4倍。与继发感染组相比，热毒宁注射液高、低剂量组Th1/Th2比值均显著下降（P＜0.01、0.001），且热毒宁注射液高剂量组Th1/Th2比值显著低于头孢克洛组（P＜0.05），与磷酸奥司他韦组无差异。