人多能干细胞（hPSC）是进行体外再生医学、疾病模型和化合物筛选研究的重要工具。最近的研究表明，通过模拟人发展中的信号通路可以将hPSCs分化为组织特异性细胞类型。分化特定阶段的时间、持续时间和生长因子浓度决定了细胞的谱系。Jason Spence, James Wells, a和他的同事最近的工作就利用这些原理开发了一种多阶段的体外分化方案，用于形成人小肠类器官¹。通过优化操作流程开发了STEMdiff^TM肠道类器官分化试剂盒，以提高多个人胚胎干细胞（ES和诱导多能干细胞（iPS））细胞系分化的效率和一致性。STEMdiff^TM肠类器官分化试剂盒是一种无血清培养基，支持hPSCs通过三个不同的分化阶段：内胚层、中/后肠和小肠分化为人肠类器官。使用这个试剂盒进行细胞分化，可形成由极化的肠上皮形成的绒毛结构和周围的生态位因子产生的间充质组成的类器官。使用该试剂盒产生的类器官可以冷冻保存，也可以使用STEMdiffTM肠类器官生长培养基通过每7-10天传代一次来进行长期维持培养。

 

第一部分 包被培养皿

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      应分装和冷冻保存 Matrigel（货号 #354277，www.novobiotec.com）。有关分装的完整说明和建议，请查阅与 Matrigel同时提供的产品说明书。分装后的小包装可在-70℃下最多储存 6 个月。 

将一份分装好的 Matrigel加入到 25 mL 的 DMEM/F-12 中，这足以包被四个6孔培养板（1 mL/孔）或三个 100 mm 培养皿（8 mL/培养皿）。 

1)将一份分装后的 Matrigel 从-70℃取出，置于冰上解冻。

2)将24 mL的稀释培养基 DMEM/F-12+15mM HEPES加入一个50 mL试管中，并置于冰上。 

3)将解冻后的 Matrigel加入到上述50 mL 离心管中，充分混匀。如需要，可用预冷培养基冲洗试管。稀释倍数见每个批次Matrigel的COA文件。 

4)立即用稀释后的Matrigel溶液包被组织培养板。推荐的培养皿及包被体积见表1 。

 

表1 推荐的培养皿及包被体积

5)转动培养皿，使基质胶均匀包被培养皿。

6)使用前，包被的培养皿应放在室温（15-25℃）下至少1小时。请勿让培养皿上包被的基质变干。使用之前，请勿移除Matrigel溶液。 

注：如果不立即使用，培养皿必须密封，以防止蒸发（如利用 Parafilm®）。包被后的培养皿在 2 - 8℃存储，7天内使用完。 

7)使用前，提前半小时使包被好的培养皿达到室温（15-25℃）。

 

第二部分 操作流程图

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图1  STEMdiff™肠类器官试剂盒支持从hPSCs分化为人肠类器官

（A）培养人PSC通过三阶段分化，使用特定阶段的专用培养基产生人肠道类器官。（B）分化不同阶段的代表性图片。第0天内胚层分化。在培养的第3天，培养物表现出典型的定型内胚层分化特性并开始进行中/后肠分化。在中/后场分化期间（第5-7天），细胞单层释放至培养基形成中/后肠球体。将这些球体收集，用基质包裹，并在STEMdiff™肠类器官生长培养基中进一步培养成熟为肠类器官。

 

第三部分 传代用于类器官分化的细胞

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以下操作流程用于在mTeSRTM1中培养的人ES或iPS细胞从6孔板到24孔板的传代。使用高质量（分化率小于5%）的细胞至关重要。关于如何维持高质量的人ES和iPS细胞进行分化的完整说明，请参阅《操作手册：人多能干细胞培养》。

使用以下描述的团块传递方法（第三部节）。使用无菌技术进行以下操作。所显示的体积是用于从6孔培养板的一孔传代到24孔培养板一孔。如果使用其它培养皿，请做相应调整。

注：当ES和 iPSC细胞的融合率达到70%时进行传代。

1)使用 Matrigel包被24孔组织处理过的培养板（见第一部分）。 

2)分装足量的mTeSR™1并使其达到室温 (15- 25℃)。

注：切勿在37℃水浴加热 mTeSR™1。

3)通过显微镜观察并鉴定已分化的区域。用马克笔或透镜标志器在培养板底部标记这些区域。

4)用移液枪或移液管去除标记区域内这些分化的部分。每次操作时避免将培养板在培养箱外持续放置超过 15 分钟。 

注：去除分化的细胞将提高细胞分化效率。 

5)从培养孔中吸出培养基，并在每孔中加入 1 mL GCDR。 

6)室温 (15 - 25°C)孵育8分钟形成团块。

注：使用的的细胞系和解离试剂不同，孵育时间也可能不同，因此需要在显微镜下监测解离的状态从而确定最佳解离时间。

7)吸出GCRD加入1 mL mTeSR™1，使用移液枪或细胞刮轻轻刮除集落。 

注：操作时要务必小心，尽量防止打散集落。 

8)将解离的细胞聚集体转移到一个 50 mL 离心管中。[可选择]用另外的1 mL  mTeSR™1洗涤培养孔收集剩余的克隆。

注：不必对细胞聚集体进行离心。 

9)用1 mL或者2 mL移液管小心上下吹打细胞聚集体混合物，以将其打散至所需的大小。一个均匀的细胞团块悬浮液大小约50-200 μm是最佳的。不要将其制备成单细胞悬液。 

10)轻轻摇动管子，以确保细胞聚集物均匀分布。将5 μL的悬浮液转移到一个每孔添加了50 μL的D-PBS（不含Ca²⁺和Mg²⁺）的96孔板的一孔中。计算每孔中团块数（直径50-200μm）。

注：如果细胞聚集体 > 200 µm，重复步骤 9 - 10。

11)按照下面的方法计算接种6000个团块需要的团块悬液体积(µL) ：

团块悬液体积 (µL)=6000个团块/（5 µL样本中的团块/5 µL）

12)在添加了0.5 mL mTeSR™1的24孔板中的每孔中接种含有6000个团块的适当体积（在步骤11中计算）。37°C下孵育，5%CO₂和95%湿度。通过千欧左右摇动培养板确保细胞均匀分布在培养孔中。24小时内不要扰动培养板。

注：推荐进行预实验，从而确定最佳的团块接种密度。接种一系列团块密度 (例如，每孔 4,000, 5,000, 和 6,000),并且在同一天进行细胞分化。

13)进行第四部分细胞分化。

 

第四部分 单层培养的hPSCs分化

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在开始分化之前，培养24小时后在显微镜下评估细胞的融合率（见第三部分）。此时细胞分化率应少于5%而融合率应该达到85-90%。如果细胞尚未达到这一水平，用0.5-1.0 mL新鲜mTeSR^TM1（无Y-27632）培养基代替培养孔中的培养基，并在37°C下再孵育24小时。增殖较慢的细胞株的初始接种密度可能需要优化。

（1）定型内胚层分化

A.定型内胚层分化培养基

第0天：准备第0天，1天和2天需要的定型内胚层分化培养基 (STEMdiff™ 内胚层基础培养基+ STEMdiff™ 定性内胚层分化添加物CJ)，每个培养孔1.7 mL。以下是准备2 mL定型内胚层分化培养基，如果准备别的体积，进行适当调整。

1)冰上解冻添加物并完全混匀。

注：如果不立即使用，分装并储存于-20°C。不要超过添加物的效期。分装好的添加物解冻后，应立即使用。避免反复冻融。

2)室温（15-25℃）或者2-8℃过夜解冻整瓶内胚层基础培养基。完全混匀。

注：如果不立即使用，在2-8℃存储2个月内用完。也可以分装储存于-20°C。不要超过培养基标签上的日期。分装好的添加物解冻后，应立即使用或储存于2-8℃2周内用完。避免反复冻融。

3)1.98 mL预冷的内胚层基础培养基中加入200µL添加物，完全混匀。储存于2-8℃。

B. 定型内胚层分化

1)第0天：37℃预热第0天需要的定型内胚层分化培养基 (0.7 mL/孔)。将剩下的培养基储存于2-8℃。

2)吸出培养孔中的mTeSR™1。沿着孔壁逐滴加入0.7 mL定型内胚层分化培养基。

3)37℃，5% CO2 和 95%湿度孵育24小时。

4)第1天：37℃预热第1天需要的定型内胚层分化培养基 (0.5 mL/孔)。将剩下的培养基储存于2-8℃。

5)吸出培养孔中的培养基。沿着孔壁逐滴加入0.5 mL定型内胚层分化培养基。

6)37℃，5% CO₂ 和 95%湿度孵育24小时。

7)第2天：37℃预热剩余的定型内胚层分化培养基。

8)吸出培养孔中的培养基。沿着孔壁逐滴加入0.5 mL定型内胚层分化培养基。

9)37℃，5% CO2 和 95%湿度孵育24小时。

10)第3天：对细胞进行内胚层检测（9.1节）。复孔可以继续分化成中/后肠（第6.2节）。

注：在内胚层诱导过程中，细胞会经历大量的死亡。尽可能减少细胞在37°C培养箱外的时间。在24小时内胚层诱导后，细胞非常敏感，培养时需要小心更换培养基。经过72小时的孵育，将形成致密的融合单层内胚层细胞。

（2）中/后肠（MH）分化

A. MH分化培养基

第3天：准备第3-8天需要的MH分化培养基 (STEMdiff™ 内胚层基础培养基+ STEMdiff™ 胃肠道分化添加物PK+STEMdiff™ 胃肠道分化添加物 UB)，每个培养孔3.0 mL。以下是准备3.0 mL MH分化培养基，如果准备别的体积，进行适当调整。

1)冰上解冻添加物PK和UB，与基础培养基混合之前一直置于冰上。完全混匀。

注：如果不立即使用，分装并储存于-20°C。不要超过添加物的效期。分装好的添加物解冻后，应立即使用。避免反复冻融。

2)2.94 mL预冷的内胚层基础培养基中加入30 µL PK添加物和30 µL UB添加物，完全混匀。储存于2-8℃。

B. 中/后肠（MH）分化

1)第3天：将足量的MH分化培养基 (0.5 mL/孔)升温至室温(15 - 25°C)。将剩下的培养基储存于2-8℃。

2)吸出培养孔中的培养基。沿着孔壁逐滴加入0.5 mL定型内胚层分化培养基。

3)37℃，5% CO2 和 95%湿度孵育24小时。

4)第4-9天：全换液并按照下面的方法每24小时观察一次球体。

注：确保培养物在取出后30分钟内放回培养箱。

a.在显微镜下观察单层。三维结构可能最早在分化的第4天就能被看见。游离漂浮的中/后肠球体将出现在分化的第5-9天。

b.用1m L移液管，从细胞中取出0.5 mL培养基，转移到无菌的24孔平底透明培养板上，以评估从单层中提取的中/后肠球体的数量和浓度。

c.在细胞中加入 0.5 mL新鲜的MH培养基。 37℃，5% CO2 和 95%湿度孵育24小时。

注：尽管第5-9天释放的球体都能产生小肠类器官，但是细胞在中/后肠培养基中的培养的时间长短将决定小肠类器官发育的区域特征。例如，十二指肠（较短的培养时间）或回肠（较长的培养时间）²。中/后肠球最高产率的出现时间可能因hPSC细胞系不同而有所不同。对于可重复的实验结果，使用同一个时间点分化的中/后肠球，可持续地收获和开始人肠道类器官的培养。经常在第8天观察到最多的肠芽。

 

图2 中/后肠培养伴随球体的成功形成和释放

第6天分化培养的代表性图片显示了中/后肠球体的剧烈形成，通过细胞单层芽进入培养基中。图像（C）由极化的上皮细胞包围的内细胞团的典型球体形态。从左到右依次放大：2X、4X和10X。

5)球体嵌入：用移液管将各培养孔中的球体悬浮液加入24孔板的一个培养孔中进行计数。15 mL离心管中添加适当的体积，对应的大约有50个左右悬浮球（根据先前的球体计数）。进行第7.0节肠道类器官培养。

注：一个中/后肠球是直径≥75μm的细胞聚集体，可能形成一个人肠类器官。多个融合球体应该被算作一个单元，将形成一个人肠道类器官。

注：剩余的单层培养物可用于测定中/后肠形成（第9.2节）或研究随后的几天嵌合成球体的进一步分化。

 

第五部分 人肠类器官培养

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（1）人肠类器官的初始培养

A.STEMdiff™肠类器官生长培养基

1)准备接种4孔的（2 mL/孔）STEMdiff™肠类器官生长培养基（STEMdiff™肠类器官基础培养基+STEMdiff™肠类器官生长添加物+L-谷氨酰胺）体积。以下是准备2 mLSTEMdiff™肠类器官生长培养基，如果准备别的体积，相应的调整。

2)冰上解冻添加物并一直置于冰上直到与基础培养基混合。混合均匀。

注：如果不立即使用，分装并储存于-20°C。不要超过添加物的效期。分装好的添加物解冻后，应立即使用。避免反复冻融。

3)1.94 mL预冷的肠类器官生长基础培养基中加入40 µL类器官生长添加物和20 µL L-谷氨酰胺，完全混匀。储存于2-8℃在2周内用完。使用前升温至室温 (15 - 25°C)。

B.Matrigel Domes中嵌入Spheroids

1)在冰上解冻足够体积的Matrigel（培养一个dome需要50 μL的Matrigel）。将一盒无菌的100μL枪头置于-20°C。

2)当所有球体（见6.2.2节）都固定在离心管的底部，仔细吸去上清液。

3)在球体中加入1mL的DMEM/F-12+15 Mm HEPES。室温（15-25°C），300×g离心5分钟。

4)用1 mL枪头小心吸去上清液。

注：尽可能多的吸去上清液至关重要。 

5)从冰箱中取出100 μL枪头，置于生物安全柜中。

6)使用带有预冷的100 μL枪头的移液枪，在离心管中加入50 μL的冷（2-8°C）Matrigel。上下吹打5次，将球体轻轻地分配到Matrigel中。

注：不要完全清空枪头，因为这可能会引入气泡。

7)使用相同的枪头，轻轻地将嵌入的球体转移到Nunclone Delta表面处理的24孔组织培养皿的一个培养孔的中心，按如下所示操作：

a.移液枪在培养孔中心上方，保持垂直。将枪头靠近但不与培养孔底接触。

b.轻压移液枪，直到在枪头的末端看到液滴为止。

c.缓慢放下移液枪，直到液滴接触培养孔的底面。

d.轻轻将剩余的体积分配（只到吸管上的第一站）到其它培养孔，同时把移液枪从培养孔里拿开。

e.盖上培养皿。

注：快速工作以防止Matrigel成胶。但是过快地加入Matrigel也会使dome变平。

8)在室温（15-25°C）下孵育25分钟，使Matrigel固化。

9)将足够体积的STEMdiff^TM肠类器官生长培养基（0.5 mL/孔）升温至（15-25°C）。将剩余的培养基储存在2-8°C。

10)小心沿培养孔孔壁加入0.5 mL的STEMdiff^TM肠类器官生长培养基（避免扰动dome）。盖好培养皿。37°C，5%CO₂、95%湿度条件下孵育。

11)每3-4天更换一次培养基，如步骤9-10所述，吸去旧培养基，添加新鲜培养基。37°C、5%CO₂、95%湿度条件下孵育。

12)孵育7-10天后，进行第五部分（2）节。

（2）人肠类器官传代

图2 使用STEMdiff™肠类器官试剂盒生成人肠类器官

 

嵌入的中/后肠球体在STEMdiffTM肠类器官生长培养基中培养，每7-10天传代一次，成熟为肠类器官。每幅图下面显示了传代次数和嵌入后的天数。放大倍数：2X。

1)准备足以接种4个培养孔（2 mL/孔）的STEMdiffTM肠类器官生长培养基（见第五部分（1）A节）。

2)在冰上解冻足够体积的Matrigel（培养一个dome需要50 μL的Matrigel）。将一盒无菌的100 μL枪头置于-20°C。将DMEM/F-12+15 mM HEPES置于冰上。

3)按照下列方法润洗15 mL离心管（每个dome一根）：

a.在试管中加入1-2 mL抗粘附冲洗液，旋转包被管子。从管中吸去冲洗液。

b.在管中加入5 mL D-PBS（不含Ca²⁺和Mg²⁺）。旋转冲洗管子。

c.尽可能多地吸去管中液体。

d.将所有被包被的管子盖紧，并在室温（15-25°C）下储存，直到需要为止。

4)从dome培养物中吸去培养基。使用1mL的吸管，在含有类器官的dome上加入1 mL预冷的DMEM/F-12。直接吹打dome几次，直到dome破碎分离。

5)使用1mL的吸管，将悬浮液转移到润洗的15 mL离心管中..

注：通过在显微镜下对培养孔进行检查，确认成功收获类器官。如果培养孔中有残留的类器官，重复步骤4-5。

6)摇动离心管，然后再冰上孵育5分钟。

注：可能需要更长的孵育时间，以确保所有的类器官碎片都已沉淀到离心管底部。

7)弃去上清液。

8)加入1mL预冷DMEM/F-12。使用1 mL移液管，上下吹打分解类器官，直到产生均匀的器官碎片悬浮液（碎片大小100-500 μm）。

注：通常上下吹打5-10次会产生所需大小的类器官碎片.

注：如果类器官长得很大，可能需要一个200 μL的移液枪进一步分解类器官。类器官碎片应通过200μL枪头。避免继续吹打，将器官分解成成单细胞悬液。

 

图3 类器官传代

 

传代类器官典型代表图片。传代数、嵌入后的天数和分配比例显示在每张图下面。放大倍数：2X。

9)期望的类器官密度由碎片计数或分配比决定。将多余的类器官悬浮液分配到另一个润洗的15 mL离心管中或丢弃。

注：每个器官碎片都可以产生一个新的肠道类器官。每个dome培养物接种40-80肠器官碎片是最佳接种密度的。

10)室温（15-25°C）200×g离心5分钟。小心弃去上清液。

注：尽可能多的吸去上清液至关重要。

11)将100 μL枪头从冰箱取出，置于生物安全柜中。

12)使用带有冷的100 μL枪头的移液枪，将50 μL预冷的（2-8°C）Matrigel加入类器官中。通过上下轻轻吹打，将器官碎片分配到Matrigel中。

注：不要完全清空移液枪，因为这可能会引入气泡。

13)使用相同的枪头，轻轻地将嵌入的球体转移到Nunclone Delta表面处理的24孔组织培养皿的一个培养孔的中心，如下所示：

a.将移液枪在培养孔中心上方，保持垂直。将枪头靠近但不与培养孔底接触。

b.轻压移液枪，直到在枪头的末端看到液滴为止。

c.缓慢放下移液枪，直到液滴接触培养孔的底面。

d.轻轻将剩余的体积分配（只到吸管上的第一站）到其它培养孔，同时把移液枪从培养孔里拿开。

e.盖上培养皿。

注：快速工作以防止Matrigel成胶。但是过快地加入Matrigel又会使dome变平。

14)在室温（15-25°C）下孵育25分钟，使Matrigel成胶。

15)将足够体积的STEMdiffTM肠类器官生长培养基（0.5 mL/孔）升温至室温（15-25°C）。将剩余的培养基储存在2-8°C。

16)小心沿培养孔壁加入0.5 mL的STEMdiffTM肠类器官生长培养基（避免扰动dome）。盖好培养皿。37°C下孵育，5%CO2和95%湿度条件下孵育。

17)每3-4天更换一次培养基，如步骤15-16所述，吸去旧培养基，添加新鲜培养基。 

18)每7-10天传代一次。传代时间依赖于类器官接种密度、大小和形态。

 

第六部分  人PSC源肠类器官冻存和复苏

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人PSC-源性肠类器官一旦完全建立并成熟，就可以在早在传代3代的时候进行冻存。为了取得最佳效果，在冻存前，应在STEMdiff™肠道类器官生长培养基中培养至少培养7天，但不超过10天。而且为了保证冻存和复苏效果，需要使用高质量的类器官。如果类器官已经解冻，则应在重新冻存前至少传代2次。

（1）类器官冻存

注：用防粘连冲洗液润洗任何枪头或移液管至关重要，这样操作可以最大限度地减少因黏附而造成的类器官碎片的损失。

1)从dome培养物中吸去培养基。使用1 mL移液管，在含有类器官的dome上加入1 mL预冷的DMEM/F-12。直接在dome上吹打几次，直到dome破碎分离。 

2)使用1 mL移液管，收集所有培养孔中的悬液在一支润洗的15 mL离心管中。

注：在显微镜下对器官培养进行检查，确认成功收获类器官。如果培养孔中有残留的类器官，重复步骤1-2。

3)摇动离心管，置于冰上孵育5-10分钟。

注：为了确保所有的类器官碎片已全部沉到管底可能需要更长的孵育时间。 

4)弃去上清。

5)加入1 mL预冷的DMEM/F-12重复步骤3-4。

6)每收获一个24孔板加入1 mL预冷的DMEM/F-12。使用1mL移液管，上下吹打解离类器官，直到产生均匀的类器官碎片悬浮液（碎片大小100-500 μm）。避免形成单细胞悬液。 

注：上下吹打5-10次通常就会产生所需大小的类器官碎片。

注：如果类器官长得很大，可能需要一个200 μL的移液枪进一步破碎类器官。类器官碎片应正好通过200 μL枪头。避免继续吹打，将器官解离成单细胞悬液。

7)将5 μL类器官碎片悬液转移到一个平底96孔板的1孔中，培养孔中预先添加了50 μL D-PBS（不含Ca²⁺和Mg²⁺）。计数培养孔内类器官碎片总数。将含类器官悬液的15 mL离心管置于冰上。

8)计算悬液中类器官碎片的总量，从而确定类器官冻存密度。我们建议每支冻存管冻存2000-8000个类器官团块，以达到最佳的长期储存和复苏效果。

9)在新的润洗的15 mL离心管中加入适当体积的类器官团块悬浮液。

10)室温（15-25°C），200×g离心5分钟。小心弃去上清液。

11)对于每支要用的冻存管，用1 mL的预冷的CryostorCS10冻存液重悬类器官碎片。通过轻轻上下吹打，将类器官碎片分配到Cryo StorCS10中。

12)使用1 mL的移液管，将1 mL类器官碎片悬浮液转移到预先标记好的冻存管中。将冻存管放入冷冻容器中。

注：需要不断摇动15 mL离心管，从而使类器官碎片均匀分布在冻存管内。

13)将冻存管转移到长期液氮储存（-135°C）前，将冷冻容器转移到-80°C冰箱至少冻存24小时。

（2）类器官复苏

注：用抗粘附冲洗液润洗任何枪头或离心管至关重要，这样操作可以尽可能减少类器官碎片在塑料器皿上的黏附。

1)从液氮中取出类器官冻存管，立即将冻存管放入37°C水浴中。

2)密切观察解冻过程，并在器官碎片完全解冻前从水浴锅中取出冻存管。

注：解冻过程不应超过1分钟。

3)使用2 mL移液管，吸取2 mL DMEM/F-12仔细清洗类器官碎片，使类器官碎片悬液完全解冻。

4)将清洗后的类器官碎片转移到15 mL离心管中。200×g离心5分钟。

5)小心弃去上清液，用2 mL DMEM/F-12重悬类器官碎片。

注：切勿一直吹打，避免将碎片吹打成单细胞悬液。

6)将类器官碎片悬液分装在15 mL离心管中，使每支离心管都包含预期要嵌入的类器官碎片数量。我们推荐嵌入250 - 1000个碎片。

注：接种高密度的碎片要比接种地密度碎片传代时间早。

7)200 x g离心5分钟。尽可能多的弃去上清液。

8)进行第五部分第（2）节步骤1-3和11-17类器官碎片嵌入和维持培养。

9)嵌入后每天评估类器官，以确定是否需要传代。复苏后的类器官比未被冻存过的类器官显得小。类器官变暗说明已经可以传代了。通常，这将发生再嵌入后4-7天。

10)在传代复苏后的类器官时，根据类器官密度、大小和形态，传代时间将恢复到每7-10天一次。

 

第七部分 不同分化培养物的表征

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（1）内胚层细胞表征

用下列抗体标记后，可用流式细胞仪测定内胚层细胞的纯度：

 

用下列抗体标记后，也可通过免疫细胞化学来评估细胞：

注：结果可能因使用的细胞系而不同。相关的荧光二抗请参考网站：

http://www.nwbiotec.com/index.php?g=&m=article&a=new_nav_list&newid=170

 

（2）中/后肠细胞的表征

用下列抗体标记后，可用流式细胞仪测定中/后肠的纯度：

 

用下列抗体标记后，也可通过免疫细胞化学来评估细胞：

注：结果可能因使用的细胞系而不同。相关的荧光二抗请参考网站：

http://www.nwbiotec.com/index.php?g=&m=article&a=new_nav_list&newid=170

 

（3）肠类器官表征

 用下列抗体标记后，可用免疫细胞化学测定肠类器官的纯度：

 

第八部分 常见问题及解决方法

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第九部分 参考文献

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1. Spence JR et al. (2011) Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature 470(7332):105–9.

2. Tsai YH et al. (2017). In vitro patterning of pluripotent stem cell-derived intestine recapitulates in vivo human development. Development 144(6):1045–55.

 

附录 试剂、材料和设备

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主要试剂

 

其它试剂和材料