骨缺损可由牙周炎、创伤、肿瘤和先天畸形等多种因素引起。尽管骨组织具有一定的再生和恢复能力，但大面积骨缺损仍会影响患者的功能、外观和生活质量。因此，修复骨组织缺损一直是临床治疗中亟待解决的问题。骨组织工程的发展离不开种子细胞、生物支架和生物活性因子这三个基本要素。近年来，细胞来源的脱细胞细胞外基质（dECM）作为一种生物活性支架材料备受关注。dECM是由细胞在体外沉积，并通过物理或化学方法去除细胞后获得的，保留了多种生物活性因子和理化信号。

先前的研究通过大鼠来源的间充质干细胞制备了四个阶段性dECM（0天、7天、14天和21天dECM），并发现14天dECM（14d-ECM）比其他dECM具有更好的成骨诱导效果。蛋白质组学测序结果显示，在14d-ECM中高表达的IV型胶原A2（COL4A2）可能通过激活FAK–PI3K–AKT信号通路发挥重要作用。同时，根据高含量和与COL4A2的相互作用，筛选出整合素亚基α7（ITGA7）和ITGA8。然而，COL4A2是否以及如何正向影响dECM的成骨分化尚不清楚。

COL4A2是IV型胶原家族的成员，是大多数组织上皮和血管内皮基底膜的主要结构成分。COL4A2通过结合整合素受体和其他细胞表面分子介导细胞与基底膜的粘附，参与细胞相互作用。研究表明，COL4A2可促进胚胎干细胞向内皮细胞分化，并通过结合骨形态发生蛋白（骨形成蛋白和骨桥蛋白-1）参与血管生成和骨生成。FAK在骨组织再生中具有多种作用，例如参与新骨的成骨作用，增强骨髓细胞对合成代谢机械刺激的反应，促进软骨细胞合成，以及促进成骨细胞粘附和迁移。PI3K–AKT通路是FAK下游最关键的信号通路之一，并参与骨形成。例如，miRNA-21通过PI3K–AKT通路促进骨髓间充质干细胞（BMSC）迁移和成骨分化，而FGF-21通过PI3K–AKT信号通路改善骨缺损愈合。其他研究也证实PI3K–AKT通路在成骨细胞形成、分化和成熟中至关重要。

特定的细胞外基质（ECM）成分通过跨膜受体（主要是整合素）将信号传递到细胞内部。ITGA7和ITGA8是整合素家族的成员。ITGA7可激活FAK，在肌细胞生长、稳定和存活中起重要作用，而ITGA8介导多种细胞过程，如细胞粘附和细胞骨架重排。ITGA8的高表达促进BMSC迁移，这与FAK通路激活有关。然而，在dECM成骨诱导过程中的关键受体尚未确定。

本研究旨在探讨COL4A2在dECM中促进体外成骨分化的作用，并探究COL4A2是否通过激活FAK–PI3K–AKT通路影响dECM的成骨分化，最后确定COL4A2与ITGA7/8之间的关系，从而阐明该级联反应中的关键受体。

本研究涉及临床样本的实验均经中南大学湘雅医院伦理委员会批准。

人骨肉瘤细胞系U2OS细胞在含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中，于37°C、5% CO₂的湿润培养箱中培养。

分别使用质粒和小干扰RNA（siRNA）转染上调和敲低COL4A2。用靶向COL4A2的两种siRNA或阴性对照siRNA转染U2OS细胞。使用p2xFlag CMV2-COL4A2-S127A突变体质粒过表达COL4A2 48小时，阴性对照为pcDNA3.1Xflag-v5-ccdB质粒。经过14天体外成骨诱导后，采用冻融法进行脱细胞处理，获得COL4A2过表达（OE）和敲低dECM。

将U2OS细胞接种在COL4A2 OE和敲低dECM上。COL4A2的OE组及其对照分别命名为OE和对照（ON）。COL4A2的敲低组及其对照分别命名为沉默1（SI1）、沉默2（SI2）和对照（SINC）。经过7天成骨诱导后，评估成骨分化效果。

通过碱性磷酸酶（ALP）活性检测、茜素红染色钙化结节以及定量实时逆转录PCR（RT-qPCR）分析ALP、OCN（骨钙素）、COLI（I型胶原）和BMP2的表达水平来评估成骨分化效率。

dECM经2%戊二醛固定、脱水、干燥和喷金后，使用扫描电子显微镜（SEM）观察其形态特征。

使用Hoechst 33342/PI细胞凋亡检测试剂盒对细胞进行染色，通过荧光显微镜观察不同状态细胞（正常细胞、凋亡细胞、坏死细胞）的分布。

通过Western blotting检测细胞中FAK–PI3K–AKT通路关键分子（COL4A2、FAK、PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT）的表达水平和激活状态。以GAPDH作为内参。

通过免疫荧光双标法（使用抗COL4A2、ITGA7、ITGA8的一抗和相应的荧光标记二抗）在U2OS细胞中检测COL4A2与ITGA7/8的共定位情况。

在确认ITGA7与COL4A2共定位后，在COL4A2 ON/OE/SINC/SI1/SI2 U2OS细胞中转染敲低ITGA7的siRNA（Si-ITGA7）。验证敲低效率后，检测成骨分化效率和FAK–PI3K–AKT信号通路的激活状态。

数据以均值±标准差表示。使用SPSS 17.0进行统计分析。两组间比较采用t检验，多组间比较采用方差分析。p < 0.05认为有统计学意义。

首先成功构建了COL4A2 OE质粒和siRNAs，并在U2OS细胞中验证了蛋白水平。脱细胞后，Western blotting证实dECM保留了脱细胞前的COL4A2蛋白水平特征。将U2OS细胞重新接种于COL4A2 OE和敲低dECM上，诱导成骨7天后，通过茜素红染色、ALP活性测定和成骨相关基因（BMP2、RUNX2、COLI）mRNA水平检测评估成骨分化状态。结果显示，OE组的钙化结节显著大于ON组，ALP活性及BMP2、RUNX2、COLI的mRNA水平也显著高于ON组，表明OE组能促进成骨分化。相比之下，SI1和SI2组的茜素红染色比SINC组浅，其ALP活性和BMP2、RUNX2、COLI mRNA水平也显著低于SINC组，表明敲低COL4A2抑制了成骨分化。

通过SEM观察ON/OE/SINC/SI1/SI2 dECM的形态特征，发现OE组和SINC组具有相对致密的孔结构，可能更有利于细胞粘附。Hoechst 33342/PI双染色显示，OE组有更多的正常细胞簇，而ON组有更多凋亡细胞，SINC组主要为坏死细胞，SI1和SI2组坏死细胞簇更明显，表明高表达COL4A2的dECM可能更有利于细胞存活。

将U2OS细胞接种于OE和ON dECM上，诱导成骨7天后，Western blotting检测显示，OE组细胞中FAK、PI3K、P-PI3K、AKT和P-AKT的蛋白表达量显著高于ON组，表明OE组显著激活了FAK–PI3K–AKT信号通路。同样，在SINC、SI1、SI2 dECM上，SI1和SI2组这些关键蛋白的表达量低于SINC组，表明敲低COL4A2抑制了该通路。这说明调节U2OS细胞中COL4A2的表达水平显著影响FAK–PI3K–AKT信号通路的激活，该通路在成骨分化中至关重要。

用不同浓度（0, 50, 100, 200, 400 μmol/mL）的RGD三氟乙酸盐（RGD）整合素受体抑制剂处理U2OS细胞。Western blot结果显示，FAK–PI3K–AKT通路关键蛋白的激活状态随RGD浓度增加先升高后逐渐被抑制。选择效果显著的200 μmol/mL RGD进行后续实验。在制备好的ON、OE、SINC、SI1、SI2 dECM上重新接种U2OS细胞，并加入200 μmol/mL RGD，诱导成骨7天后，发现添加RGD后，COL4A2 OE和敲低组的茜素红染色均比未加抑制剂的对照组浅，且ALP活性及BMP2、COLI、RUNX2 mRNA水平均显著降低，表明阻断整合素受体显著抑制了U2OS细胞的成骨分化功能。

基于前期蛋白质组学结果，筛选ITGA7和ITGA8作为潜在的关键整合素受体。通过免疫荧光双标发现，COL4A2与ITGA7在细胞内共定位，而与ITGA8的共定位不明显。推测COL4A2可能首先与ITGA7结合发挥作用。随后构建Si-ITGA7并转染至U2OS细胞，Western blotting验证了其在蛋白水平的敲低效率。

将U2OS细胞重新接种于ON、OE、SINC、SI1、SI2 dECM上并敲低ITGA7后，Western blotting检测显示，与相应对照组相比，敲低ITGA7后，各组细胞中FAK、PI3K、P-PI3K、AKT和P-AKT的蛋白表达量均降低，表明敲低ITGA7抑制了FAK–PI3K–AKT信号通路。同时，通过茜素红染色、ALP活性测定以及BMP2、RUNX2、OCN mRNA水平检测评估成骨分化效率，发现敲低ITGA7后，所有dECM组别的U2OS细胞成骨分化能力均受到抑制。这些结果强调了ITGA7在成骨分化中的重要性，提示它可能是调节骨形成信号通路的关键介质。

组织工程为修复骨缺损提供了新途径。支架是组织工程的三大要素之一，一直备受关注。dECM是一种通过去除现有骨基质中的细胞成分同时保留独特ECM微观结构和原始成分的天然支架。dECM具有良好的生物相容性，有利于细胞增殖和骨整合，并能增强骨矿化、再生和骨折恢复。本研究首次验证了COL4A2的成骨促进作用。结果显示，COL4A2 OE组比敲低（ON）组表现出显著增强的ALP活性、更高的关键成骨基因（BMP2、RUNX2、COLI）mRNA水平以及更大的钙化结节。而COL4A2敲低（SI1和SI2组）则导致ALP活性抑制、BMP2、RUNX2、COLI mRNA水平降低以及钙化结节变小。ALP活性与成骨分化初始阶段和整体功能状态密切相关。BMP-2是早期成骨细胞分化的关键调节因子。RUNX2控制成骨细胞发育标志基因的表达。COLI是晚期成骨细胞分化和基质成熟的关键标志物。钙化结节是支持晚期成骨分化和ECM后续矿化的重要形态学指标。因此，COL4A2作为基底膜的关键结构成分，既为细胞提供必要的结构支持，又主动调节其生物学行为。

本研究使用U2OS人骨肉瘤细胞系，该细胞系适用于研究成骨细胞分化和增殖。我们通过将COL4A2质粒和siRNA转染到U2OS细胞中，分别构建了COL4A2过表达和敲低的14天dECM，并重新接种细胞以研究这些dECM的成骨效果。结果证实OE组成骨分化水平显著高于ON组，而SI1/SI2组成骨水平显著低于SINC组。在支架中引入外源性成骨因子难以确保安全性，因此，本研究发现的内源性成骨因子COL4A2的作用对于构建安全高效的支架材料具有重要意义。

其次，我们聚焦于COL4A2在体外促进细胞成骨分化的具体机制。FAK是一种非受体酪氨酸激酶，具有ECM和细胞的特定结合位点，因此被认为是骨组织工程中连接间充质干细胞、生长因子和生物材料/支架的桥梁因子。FAK在细胞增殖、迁移、存活、侵袭和分化中起重要作用，尤其是在BMSC成骨分化过程中。FAK激活后向多个下游通路发送信号，其中PI3K–AKT是其主要的信号靶点之一。FAK–PI3K–AKT信号通路在促进成骨分化中非常重要。本研究通过将U2OS细胞接种于ON、OE、SINC、SI1、SI2 dECM上，并经Western blotting验证，直接表明COL4A2显著激活了FAK–PI3K–AKT通路。因此，COL4A2很可能通过激活FAK–PI3K–AKT通路来促进细胞成骨分化。ECM蛋白可与整合素结合激活FAK磷酸化，进而通过调节下游PI3K–AKT和Wnt信号通路促进成骨细胞分化。我们的研究表明，COL4A2过表达显著增强FAK磷酸化，从而增强PI3K/AKT信号通路活性并驱动成骨分化。AKT的激活可诱导下游GSK3β磷酸化，从而防止β-连环蛋白降解并促进其积累。此过程激活Wnt/β-连环蛋白信号通路，刺激成骨因子表达，最终促进成骨分化。此外，PI3K/AKT信号通路可通过激活下游mTOR信号通路促进成骨细胞增殖和分化。

特定的dECM成分必须通过跨膜受体从细胞外信号传递到细胞内信号，整合素是主要的细胞表面受体。整合素是由α和β亚基组成的异二聚体，充当细胞机械传感器。整合素在介导粘附、调节细胞迁移、细胞周期进程、存活、分化和各种信号转导中至关重要。基于前期研究，我们推测ITGA7和ITGA8可能是激活FAK–PI3K–AKT信号通路的关键受体。验证推测后，通过细胞免疫荧光共定位筛选U2OS细胞中的COL4A2和ITGA7/8。免疫荧光双标实验中，COL4A2和ITGA7显示出明显的荧光信号重叠，推测COL4A2可能通过此途径与细胞表面相互作用，随后内化到细胞中以发挥其他成骨相关的生物学功能。确定COL4A2与ITGA7而非ITGA8共定位。因此，我们在接种于ON/OE/SINC/SI1/SI2 dECM上的U2OS细胞中敲低ITGA7，并在成骨诱导7天后检测成骨效率和FAK–PI3K–AKT通路激活状态。结果显示，敲低ITGA7明显抑制了FAK–PI3K–AKT通路并降低了成骨分化效率。

整合素作为必需的跨膜蛋白，主要通过其与ECM蛋白的结合来调节细胞粘附。它们还激活成骨相关通路以控制干细胞分化。通过调节细胞形态和细胞骨架重组，整合素影响成骨细胞的功能。此外，该受体蛋白家族参与调节破骨细胞的粘附和骨吸收活动，从而维持骨吸收和骨形成之间的平衡。ITGA7作为整合素α家族成员，在成骨中起关键作用。已有报道抑制ITGA7表达可促进小鼠破骨细胞生成并改变卵巢切除术诱导的骨吸收。另有研究发现ITGA7通过PI3K–AKT信号通路影响成骨过程中的细胞形态。本研究表明COL4A2与ITGA7共定位，但COL4A2与ITGA7之间的具体结合机制仍有待阐明。

本研究证实了dECM中的COL4A2与ITGA7结合，激活FAK–PI3K–AKT通路，从而促进成骨分化。我们的研究结果表明，COL4A2有希望作为骨组织工程中设计dECM支架的新靶点。我们建议开发富含COL4A2的dECM，可直接使用或与其他支架结合用于修复骨缺损。此外，信号通路的确定为调节COL4A2的成骨促进作用提供了潜在的治疗策略。将这些发现转化为临床应用可能存在潜在局限性。因此，在未来的研究中，我们将把COL4A2作为一个潜在的干预靶点，并专注于有效、便捷地调节其表达以增强成骨作用。将进一步进行体内实验以探索这些可能性。