Advances in research on hypertrophic scar formation and scar inhibition of chitin-based biomaterials

Zuhan Chen¹, Zehong Fang¹, Yanfeng Wang¹, Qifa Ye^1,2

1. Hepatobiliary disease institution, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Transplant center of Wuhan University, hubei province, 430071

2. Center of Transplant Medicine Engineering and Technology of Ministry of Health of The People´s Republic of China, The Third Xiangya Hospital of Central South University, Changsha 410013,China

[Abstract] Hypertrophic scar is the outcome of excessive deposition of extracellular matrix during wound healing after adult skin tissue defects. Itching, pain, contracture, and movement disorders can occur at the site of scar formation and affect the appearance of the patient. However, various treatment methods currently used have disadvantages such as low patient compliance, many side effects and inaccurate efficacy. In recent years, studies have found that chitin and its derivatives can slow the body's multiple fibrosis processes and inhibit scar formation by regulating collagen metabolism and other ways. This article reviews the formation of hypertrophic scars and the role of chitin-based biomaterials in the formation of hypertrophic scars.

【Keyword】hypertrophic scar ; scar ; chitin ; chitosan ; derivatives

【Fund program】Supported by Zhongnan Hospital of Wuhan University Science, Technology and Innovation Seed Fund （cxpy2017052）

创伤、手术、烧伤等造成机体部分组织细胞缺损后，纤维结缔组织增生形成瘢痕的过程，称为瘢痕修复。在瘢痕修复过程中，人类皮肤愈合以肉芽组织填充为主，肉芽组织成熟老化后形成高于皮肤的病理性瘢痕，病理性瘢痕分为局限于原有皮损平面的增生性瘢痕（hypertrophic scar，HS）和超出原有皮损平面的瘢痕疙瘩，对机体原有外观和功能产生影响。即使术中严格遵守外科操作规范，或对烧伤患者行最有效治疗，仍有32—74%患者在创口愈合时产生HS^[1. 2]。瘢痕形成可恢复皮肤完整性和维持组织强度，但产生瘙痒、疼痛、挛缩、运动障碍以及皮肤外观受损等副作用，不同程度地影响患者心理状态及生活质量。

针对手术和外伤引起的线性增生性瘢痕，指南推荐在创面上皮化后尽早联合使用将硅酮制剂和压力治疗，对于预防效果不佳的小面积瘢痕可局部注射糖皮质激素，充血严重的瘢痕可联合应用光电技术。针对因烧伤和创伤广泛生长的增生性瘢痕，建议在烧伤科行常规治疗后首选硅酮制剂敷贴，同时重视激光治疗的辅助应用，若后期出现瘢痕挛缩予手术松解^[3]。然而现有治疗手段缺点在于只能在创面上皮覆盖后开始治疗，对患者依从性要求高、没有普适性及副作用大。如穿戴压力衣和使用硅酮制剂敷贴时患者依从性不足，局部注射激素引起局部皮肤菲薄、血管扩张，甚至出现激素全身反应如库欣综合征、高血压、骨质疏松等；点阵激光的的调整与患者个体差异有关，激光治疗强度控制不当会出现多种副作用。囿于HS治疗效果的限制，采用功能性敷料预防疤痕的形成是研究的热点。

甲壳素是β(1-4)-联合N-乙酰-D-葡萄糖胺残基的多聚糖，每年自然界生物合成量多达100亿吨，为仅次于纤维素的第二大天然高分子化合物。甲壳素通过脱乙酰基处理得到壳聚糖，脱乙酰度和相对分子量影响壳聚糖的生物活性和理化性质。甲壳素、壳聚糖及其衍生物具有吸湿、抗菌、吸附、凝血、可降解、生物相容等优良特性，是具有广泛应用前景的高分子材料，研究表明甲壳素及壳聚糖等天然高分子化合物能够通过多种途径抑制瘢痕形成，本文就瘢痕形成及甲壳素基生物材料在瘢痕形成的作用和机制进行综述。

1. 增生性瘢痕

1.1 增生性瘢痕的形成过程

成人的伤口愈合以瘢痕修复为主，分为止血、炎症反应、细胞增殖和组织重构四个步骤，各步骤相互重叠并受各种促纤维化和抗纤维化因子调控。机体在受到创伤后激活内源及外源凝血途径，血小板黏附至伤口处，形成纤维蛋白凝块止血并分泌大量细胞因子。随后炎性细胞趋化、微血管及肉芽组织形成以填补缺损和保护创面，促进表皮细胞再生、成纤维细胞（fibroblast，Fb）大量合成以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的细胞外基质(excetralcellular matrix，ECM)，继而肉芽组织成熟老化为纤维结缔组织，同时在基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的降解作用下完成组织重构。在正常成人的瘢痕增殖期，Fb和微血管数量逐渐增加，促纤维化分子表达增加；瘢痕退化期Fb和微血管数量逐渐减少，促纤维化分子表达减少^[4]。加重或延长的炎症反应会促进血管形成、细胞增殖，使胶原过度沉积，促进HS的形成^[5]。

1.2 增生性瘢痕形成的分子机制

转化生长因子β（TGF-β）是瘢痕形成的关键因素。研究表明，下调TGF-βⅠ型受体表达可减少ECM沉积，减少瘢痕的形成^[6]。TGF-β主要与潜活性相关蛋白（latency associated peptide）结合形成无活性的复合体储存于血小板，组织受损后血小板粘附于伤口并释放TGF-β，与TGF-β Ⅰ、Ⅱ型受体结合形成三聚体后，经smad蛋白将信号传导至胞浆、细胞核内，调节蛋白合成。TGF-β促进HS形成的机制有：①刺激Fb趋化和增殖，通过TGF-β/Smad通路促进胶原合成；②粘附性糖蛋白和整合素合成增加，介导细胞和ECM的粘附作用；③下调组织中MMP表达，上调金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor of matrix metalloproteinase，TIMP）表达以减少胶原降解；④诱导瘢痕组织Fb向肌成纤维细胞转化^[7. 8]。

MMPs是一组在降解ECM中起关键作用的锌离子依赖性肽链内切酶，主要由真皮层成纤维细胞和白细胞分泌，其活性状态可由TIMPs特异性抑制。二者相对含量的变化在创伤愈合和组织重构过程中起重要作用，基质合成过度或降解不足可导致病理性瘢痕的形成。在增殖期HS组织中MMPs和TIMPs表达明显上升，而MMP与TIMP表达量比值下降，提示瘢痕组织中MMP/TIMP减少可能会促进胶原合成和ECM沉积，致使伤口在愈合过程中发生严重纤维化反应^[9]。相反的，MMPs与TIMPs表达比值增高可能与生物的无瘢痕愈合有关^[10. 11]。

VEGF是已知作用最强的促血管生成因子，在增殖期瘢痕组织中表达明显增强，后随瘢痕退化逐渐下降，在成熟瘢痕中表达仍略高于正常皮肤^[4]。伤口愈合过程中微血管过度生成为瘢痕中Fb增殖和胶原分泌提供更多营养支持，促进病理性瘢痕的形成和发展。VEGFR-2具有很强的酪氨酸激酶活性，在血管生成的信号传递中起主导作用，VEGF与VEGFR-2结合后激活多个信号通路，如MAPK通路、PI3K/AKT，使参与调节内皮细胞增殖和迁移、上调血管通透性增加相关的基因表达^[12]。研究发现应用VEGF抗体、内皮抑素或重组人血管内皮抑素可通过减少血管生成抑制HS增生^[13-15]。

如碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）参与调节ECM合成和降解、干扰胶原蛋白分布，也可通过抑制TGF-β/Smad通路实现瘢痕抑制效果，临床试验表明bFGF对防治病理性瘢痕有明显效果^[16. 17]。真皮网状层的慢性炎症与增生性瘢痕形成关系紧密，抗炎治疗可有效减缓瘢痕形成，然而研究证实高浓度的TNF-α可抑制Fb增殖和分泌，亦可降低α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）表达以减少肌成纤维细胞的生成，故TNF-α表达降低可能与增生性瘢痕的形成有关^{[18. 19]}。

2.甲壳素基材料与瘢痕形成

甲壳素及其衍生物基于良好的生物相容性、生物可降解性、无过敏性和无免疫原性，已被广泛应用于医疗领域，可通过在伤处吸附血清蛋白，调节胶原代谢，诱导表皮细胞和内皮细胞增殖达到止血、抗粘连、促进伤口愈合的作用。目前研究发现甲壳素及其衍生物能通过多种途径抑制瘢痕形成：①抑制Fb增殖和分化，减少胶原分泌并降低I、III型胶原比，增强胶原酶的降解作用；②调节炎性细胞功能，影响细胞因子表达、胶原堆积、血管生成等各项环节；③具有血管生成抑制作用和广谱抗菌性，通过减少新生血管和控制感染抑制瘢痕形成^[20]。

甲壳素基材料在促进组织愈合和抑制瘢痕均有显著效果。需要说明的是，瘢痕形成是愈合后期不可或缺的重要阶段，然而愈合前期和组织塑形阶段在组织构成方面存在许多截然相反的改变，如伤口愈合前期出现大量新生血管、Fb大量增殖和分泌、ECM堆积以支撑和维持组织的结构和功能，而超出修复所需的血管生成和ECM堆积是病理性瘢痕形成的原因，其他影响因素如TGF-β1在愈合前期过度表达而未及时下调同样难辞其咎。因此，防治瘢痕需要平衡愈合前期与瘢痕形成时期ECM的积聚-重构关系，即ECM合成高峰提前并维持在正常水平。

目前研究认为甲壳素基材料在伤口愈合过程中呈现双相作用，即甲壳素及其衍生物针对不同组织来源或愈合阶段的成纤维细胞，在增殖分泌方面表现出不同的作用特性，在体实验中TGF-β1表达量也随时间表现出差异，证实甲壳素基材料在创伤愈合过程具有促进组织愈合-抑制瘢痕形成的双相作用^[21-23]。早期胚胎真皮成纤维细胞祖细胞可分化为上乳头状成纤维细胞、下网状成纤维细胞等多种细胞类型，其中下网状成纤维细胞在创面愈合中起主导作用，且不同区域和时间点的Fb在产物表达和细胞周期等方面存在差异，提示甲壳素基材料表现出的双向作用可能与愈合过程中Fb构成和组织内环境的改变有关^{[4. 24. 25]}。

3.甲壳素、壳聚糖及其衍生物的瘢痕抑制作用

研究表明甲壳素、壳聚糖及其衍生物能够抑制机体多种纤维化进程。Zahir JF等^[26]发现壳聚糖和巯基化壳聚糖可通过下调TGF-β1和VEGF表达抑制Fb的增殖分化等多种途径预防角膜混浊的发生。Zhou LL等^[27]发现壳聚糖气溶胶可缓解大鼠模型中脂多糖诱发的肺纤维化，MMP-3和TIMP-1表达下降。以此为背景，研究者认为甲壳素、壳聚糖及其衍生物能够以多种途径抑制HS的形成。

3.1 甲壳素的瘢痕抑制作用

Okamura Y等^[28]使用甲壳素、壳聚糖与其寡聚体和单体刺激不同来源的Fb，结果示各组材料均能促进成人Fb组织MMP-1的释放，其中以甲壳素单体作用效果最强。Ikuko Ito等^[29]建立三维人造皮肤模型后局部应用甲壳素纳米纤维和纳米晶体，发现甲壳素保护表皮再生，这种保护机制可能与抗炎因子TGF-β表达下降有关。

3.2 壳聚糖的瘢痕抑制作用

壳聚糖具有良好的水溶性，相较甲壳素更易于加工，关于壳聚糖的瘢痕抑制效果研究更为广泛。张敬德等^[30]使用壳聚糖处理来源于瘢痕周围正常皮肤、HS和瘢痕疙瘩的Fb，发现壳聚糖抑制Fb增殖和胶原合成、TGF-β1和FGF分泌量减少、IL-8分泌量增加并且呈剂量依赖效应，与Fb来源无关。Iyer SR等^[31]发现壳聚糖能够通过重组肌动蛋白和整合素β1网络降低Fb粘附性，进而抑制其增殖分泌过程。肌成纤维细胞由Fb分化而来，胞质中特征性的含有α-SMA，其占比增高被认为是引起瘢痕挛缩的原因，壳聚糖可通过阻断α-SMA的产生减少肌成纤维细胞的生成^[26]。

HS组织中一氧化氮合酶表达相对皮肤明显减少，给予瘢痕Fb组一氧化氮供体硝普钠后胶原表达显著降低。Lv C等^[20]从患者疤痕分离培养Fb，使用浓度梯度的壳聚糖刺激后，检测发现来自正常组织、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的成纤维细胞的TGF-β1和bFGF分泌均减少，IL-8分泌增加，呈剂量依赖性，证明壳聚糖通过影响细胞因子表达抑制瘢痕形成。

Hou H等^[32]发现壳寡糖可有效减少神经瘢痕的形成，对于直径较小的血管（＜50μm）壳寡糖组仅在瘢痕形成后期表现为抑制效应，而对于大血管（≥50μm）壳寡糖组在瘢痕形成初期和后期均表现为抑制，提示壳寡糖对新生血管的抑制作用可能随愈合过程和组织成分改变而产生差异。另外，伤口感染加重组织破坏，延缓伤口愈合并促进瘢痕形成。壳聚糖的广谱抗菌作用与其丰富的氨基有关，其抗菌能力随着脱乙酰度增加而增强，壳聚糖既能够吸附带负电的细胞壁形成高分子膜阻碍物质运输，又能进入细胞内与带有阴离子的细胞质产生絮凝作用达到杀菌效能，进而抑制瘢痕形成^[33]。

3.3 甲壳素和壳聚糖衍生物的瘢痕抑制作用

通过对甲壳素和壳聚糖进行化学改性，可得到性能更为优良的衍生产物。吴丹等^[34]使用浓度梯度6-O-羧甲基壳聚糖处理人瘢痕Fb，亦表现出抗瘢痕作用，且呈浓度依赖效应。宋镇等^[35]则将6-O-羧甲基壳聚糖局部注入兔耳腹侧瘢痕，结果示实验组Fb密度下降，排列松散，血管减少，胶原纤维疏松排列规则，与曲安奈德组表现出相似的瘢痕抑制效应，动物实验证实了6-O-羧甲基壳聚糖的抗瘢痕作用。Baxter RM等^[21]建立皮肤全层烧伤小鼠模型，采用基因表达谱分析和定量PCR技术动态测定烧伤愈合中各基因表达的变化，壳聚糖乳酸盐组较对照组在烧伤第三天TGF-β1和Ⅲ型胶原mRNA含量增加，而在第七天含量降低，这提示壳聚糖乳酸盐在愈合过程的生物学效应随愈合阶段改变，最终达到促进愈合且抑制瘢痕形成的效果。Jiang Z等^[36]发现羧甲基壳聚糖可下调肿瘤组织中VEGF的表达，抑制微血管的生成。此外其他研究表明，多种甲壳素和壳聚糖衍生物相较壳聚糖表现出更优越的抗菌作用^[37. 38]。

4.总结及展望

增生性瘢痕是成人皮肤损伤后伤口愈合的病理性产物，伤口愈合前期细胞因子表达，炎性细胞趋化，血管生成等因素会使肉芽组织老化形成瘢痕。不同于其他瘢痕防治手段应用的滞后性，甲壳素基材料能够以敷料形式于创面形成早期发挥预防及治疗组织愈合及抑制瘢痕的双相作用。若在目前研究基础上阐明愈合过程中组织构成和调控因子的动态变化，将有助于理解瘢痕修复的机制，进而寻找创面无瘢痕愈合的必要条件加以干预。此外，甲壳素基材料可制成薄膜、微球、纳米颗粒、纳米纤维等多种形式，搭载药物复合应用可达到更好的瘢痕抑制效果。

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