β-淀粉样蛋白（Aβ）多肽源自淀粉样前体蛋白（APP）的序列切割过程。该蛋白在阿尔茨海默病患者脑内的斑块中大量富集，因此在该疾病发病机制中起重要作用。已知APP也在背根神经节（DRG）神经元中表达，并在发育过程中促进神经元存活与轴突生长。然而，APP与Aβ多肽是否参与伤害性感知及病理性疼痛状态仍不明确。本研究通过行为学、生物化学和形态学方法，对成年大鼠及APP过表达CRND8转基因小鼠进行了探究。

研究人员发现Aβ（17-24）多肽主要表达于大鼠小型背根神经节神经元中。在足底注射完全弗氏佐剂（CFA）后，同侧腰椎L4-6节段背根神经节中APP与Aβ多肽水平显著降低。在3月龄、12月龄及24月龄的CRND8小鼠中，其对热刺激和机械刺激的疼痛敏感性较同龄野生型小鼠显著减弱。与疼痛敏感性降低相一致的是，CRND8小鼠L4-6背根神经节中P物质、降钙素基因相关肽和瞬时受体电位香草酸亚型-1等疼痛介质的表达量显著减少。

虽然在3月龄CRND8小鼠与野生型小鼠中，足底注射CFA可诱导出相似模式的炎性疼痛，但12月龄CRND8小鼠从炎性疼痛中的恢复速度较野生型更快。这些发现表明APP与Aβ多肽可同时抑制伤害性感知和炎性疼痛，且可能与临床中阿尔茨海默症患者疼痛感知迟钝现象存在关联。

一、引言

疼痛是一种令人不适的感觉。生理性疼痛在维持生命活动中具有保护作用，而急性或慢性病理性疼痛则属于疾病范畴，构成医学难题。随着人口老龄化加剧，慢性疼痛的发病率持续上升。由于其机制尚未明确，针对老年群体尤其是高龄患者的疼痛管理往往存在不足。因此，通过老年慢性疼痛模型或老龄动物研究探索慢性疼痛机制，对深化认知和开发更有效的治疗策略具有重要意义。

β-淀粉样蛋白（Aβ）是由36-43个氨基酸组成的多肽群，源自淀粉样前体蛋白（APP）。该多肽是阿尔茨海默病（AD）患者脑内斑块和神经纤维缠结的主要成分，因而参与疾病发病进程。值得注意的是，在AD患者及正常老年群体的脑脊液中均检测到高水平的Aβ多肽。

研究表明，APP及其酶解产物Aβ多肽在啮齿类动物和人类的背根神经节（DRG）小型神经元中均有表达，并参与发育过程中DRG神经元的存活与轴突生长。然而，DRG神经元中的Aβ多肽是否参与伤害性感知和病理性疼痛状态尚不明确。近期动物研究开始关注这一问题：在过表达APP的FVB/N品系小鼠中，坐骨神经完全离断后神经瘤形成较少、运动神经元存活率更高，其神经病理性疼痛和运动神经元损伤程度较轻；经Aβ1-40肽处理的3月龄瑞士小鼠也表现出疼痛耐受性增强。这些数据提示APP或Aβ多肽可能抑制伤害性感知。但炎症是否影响DRG神经元中APP和Aβ多肽的表达，以及过表达APP的转基因小鼠的伤害性感知和炎性疼痛是否改变，仍有待阐明。

本研究旨在探究以下问题：首先，检测大鼠DRG神经元中Aβ（17-24）多肽的表达及炎症对APP和Aβ多肽表达的影响；其次，在年轻与年老APP过表达CRND8转基因小鼠中，分析基础疼痛行为及足底注射完全弗氏佐剂（CFA）诱导的炎性疼痛特征；最后，为揭示疼痛行为改变机制，检测CRND8小鼠DRG神经元中三种经典疼痛标志物——降钙素基因相关肽（CGRP）、P物质（SP）和疼痛相关离子通道瞬时受体电位香草酸亚型-1（TRPV1）的表达水平。

二、实验方法

01.动物实验

本研究采用雄性斯普拉格-达利（SD）大鼠（体重200-300克，2-3月龄）及雄性APP过表达转基因小鼠（CRND8品系，体重20-30克，3、12和24月龄）。所有实验均遵循加拿大动物护理委员会指南，并经麦吉尔大学动物护理委员会批准。CRND8转基因小鼠由多伦多大学神经退行性疾病研究中心制备，该品系携带双突变人源淀粉样前体蛋白695（K670N/M671L和V717F），其APP和Aβ多肽产量及斑块沉积随年龄增长而增加。

SD大鼠每笼饲养2只，CRND8小鼠每笼饲养4-5只。动物饲养采用12小时光暗循环周期，自由摄取食物和饮水。

02.疼痛行为学测试

0201.热痛觉过敏测试

将动物置于有机玻璃观察箱中，箱底为玻璃平板，适应30分钟后采用IITC Model 336足底痛觉分析仪测量双侧后爪缩足潜伏期（PWL）。为避免组织损伤，设定10秒截止时间。每爪测量3次，每次间隔5-10分钟，取平均值作为该爪PWL。各组数据以均值±标准误表示。

0202.机械性异常疼痛测试

测试前30分钟将动物置于网状地板的独立塑料观察箱中，待其适应环境后使用IITC电子von Frey测痛仪测量缩足阈值（PWT）。仪器使用标配校准砝码进行校准后，将塑料测头垂直施加于后爪足底表面，逐渐增加压力直至出现快速缩爪或抖爪反应（阳性反应），数字记录触发压力值。双爪交替测量，每爪至少测量3次，每次间隔5-10分钟，取多次测量平均值。

采用Student t检验或单因素方差分析（ANOVA）结合Student-Newman-Keuls多重比较检验进行统计学分析，显著性水平设定为p<0.05。

03.炎性疼痛模型

通过足底注射完全弗氏佐剂（CFA）建立持续性慢性炎性疼痛模型。CFA注射前1天分别采用Hargreaves法和电子von Frey法测量基础PWL和PWT。经异氟烷短暂麻醉（诱导浓度5%，维持浓度2%）后，向3月龄和12月龄SD大鼠、野生型及CRND8转基因小鼠左后足底注射生理盐水（大鼠0.1毫升/爪，小鼠20微升/爪）或CFA溶液。于注射后4、24和48小时测量双后爪PWL和PWT值。

04.免疫细胞化学分析

为检测SD大鼠、野生型及CRND8小鼠背根神经节（DRG）中Aβ多肽、P物质（SP）、降钙素基因相关肽（CGRP）和TRPV1的表达，经心脏灌注冷磷酸盐缓冲液（PBS）及4%多聚甲醛溶液后，取L4-6节段DRG组织。样本经后固定、蔗糖溶液保护后，使用冷冻切片机制备10微米厚切片，贴附于载玻片并于-80°C保存。

切片经0.3%过氧化氢和10%正常山羊血清预处理后，分别与以下一抗孵育：小鼠抗Aβ（17-24）单克隆抗体（1:1000）、兔抗人CGRP抗体（1:1000）、兔抗SP抗体（1:1000）、豚鼠抗VR1抗体（1:1000）或生物素标记的IB4凝集素（1:500）。随后与相应生物素标记二抗（1:200）孵育，采用ABC试剂盒显色，DAB葡萄糖氧化酶-镍法增强显影。镜检使用尼康E800显微镜，设立阴性对照（省略一抗）及吸收实验（抗体预吸收过量抗原）验证特异性。

05.免疫反应阳性神经元定量

取SD大鼠（n=4）、野生型（n=5）及CRND8小鼠（n=5）L4-6 DRG切片，每动物分析5个切片。通过图像分析软件测量神经元胞体面积和平均光密度，设定细胞质密度阈值判定阳性神经元。计算各标志物阳性神经元占比，采用t检验进行组间比较（p<0.05）。对372个Aβ免疫阳性神经元按胞体面积分为小（<500μm²）、中（500-1000μm²）、大（>1000μm²）三类进行尺寸频率分析。

06.蛋白质印迹分析

SD大鼠足底注射CFA 48小时后，取L4-6 DRG组织。样本经RIPA裂解液提取蛋白，BCA法定量后，取20μg蛋白进行4-20%聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后与APP单克隆抗体（1:1000）或Aβ（1-42）抗体（1:1000）孵育，辣根过氧化物酶标记二抗（1:3000）显色。采用ECL化学发光检测系统曝光，MCID软件分析条带密度，以肌动蛋白为内参标准化。组间比较采用单因素方差分析及Student-Newman-Keuls检验（p<0.05）。

三、结果

01.Aβ（17-24）多肽主要表达于中小型背根神经节神经元

采用抗人Aβ（17-24）多肽单克隆抗体对大鼠DRG切片进行免疫染色，发现该多肽主要表达于成年大鼠中小型DRG神经元的胞体和轴突（图1A，箭头所示）。使用经Aβ1-40或Aβ1-42预吸收的抗体（图1B）及省略一抗（图1C）的对照组均未出现特异性染色，证实抗体特异性。定量分析显示约23%的DRG神经元表达该多肽，其中绝大多数属于小型（<500μm²）和中型（500-1000μm²）神经元（图1D）。

图1显示Aβ多肽主要表达于大鼠中小型背根神经节神经元。Aβ（17-24）多肽的免疫反应阳性主要分布于大鼠中小型DRG神经元中（A，箭头所示）。使用抗原预吸收抗体孵育的DRG切片未见特异性染色（B）。省略一抗的对照组仅显示背景染色（C）。标尺=100微米。尺寸频率定量分析表明，大多数Aβ免疫阳性神经元属于小型（<500μm²）和中型（500-1000μm²）DRG神经元（D）。共分析372个Aβ免疫阳性神经元，大鼠L4-6 DRG中约22.67%的神经元表达该多肽。

02.炎性疼痛状态下DRG神经元Aβ多肽水平降低

通过大鼠后足底注射CFA（100微升/爪）建立炎性疼痛模型。注射3天后，CFA注射侧后爪出现显著热痛觉过敏，较生理盐水组及对侧后爪差异显著（图2A，p<0.05）。

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蛋白质印迹分析显示，CFA注射组同侧L4-6 DRG中APP和Aβ多肽表达量显著低于生理盐水组同侧及CFA组对侧DRG（图2B-D，p<0.01）。生理盐水组双侧DRG之间及CFA组对侧与盐水组同侧之间均无显著差异。

图2显示蛋白质印迹分析证实炎症降低背根神经节中APP和Aβ多肽水平。SD大鼠左后足底注射CFA建立持续性炎性疼痛模型后，注射侧后爪的缩足潜伏期（PWL）较生理盐水注射组及对侧爪显著降低（A，*p<0.001）。同侧L4-6背根神经节中APP（B,C）和Aβ多肽（B,D）水平较对侧神经节及生理盐水组显著降低（C,D，*p<0.05）。生理盐水组大鼠双侧L4-6背根神经节的APP和Aβ多肽水平无显著差异（B,C）。数据以均值±标准误表示（n=3），采用单因素方差分析及多重比较检验。

03.CRND8小鼠痛觉敏感性随年龄增长而减弱

通过Hargreaves热痛测试和电子von Frey机械痛测试发现，3、12和24月龄CRND8小鼠的热刺激缩足潜伏期（PWL）均显著高于同龄野生型小鼠（图3A、C、E，p<0.05）。机械缩足阈值（PWT）在12和24月龄CRND8小鼠中显著升高，但3月龄组无显著差异（图3B、D、E，p<0.05）。

图3显示年轻与年老APP过表达CRND8小鼠痛觉敏感性变化。Hargreaves测试表明：3月龄、12月龄和24月龄CRND8转基因（TG）小鼠的热刺激缩足潜伏期（PWL）均显著高于野生型（WT）小鼠（A,C,E，*p<0.05）。电子von Frey测试显示：12月龄和24月龄CRND8小鼠的机械刺激缩足阈值（PWT）显著高于野生型小鼠，但3月龄组无显著差异（B,D,F，*p<0.05）。数据以均值±标准误表示（n=15-18），采用t检验进行统计分析。

04.CRND8转基因小鼠疼痛介质表达下调

在3月和12月龄CRND8小鼠中，DRG神经元内CGRP、SP和TRPV1的表达水平均显著低于同龄野生型小鼠。免疫组化定量显示，三种疼痛标志物阳性神经元的百分比均出现年龄依赖性的显著降低（图4A-G、5A-G，p<0.05）。

图4显示3月龄野生型与APP过表达CRND8小鼠背根神经节疼痛标志物表达变化。CRND8小鼠DRG神经元中CGRP（A,B）、P物质（C,D）和TRPV1（E,F）阳性神经元的平均百分比均显著低于野生型小鼠（G，*p<0.05）。数据以均值±标准误表示（n=3-5），采用t检验进行统计分析。

图5显示12月龄野生型与APP过表达CRND8小鼠背根神经节疼痛标志物表达变化。CRND8小鼠DRG神经元中CGRP（A,B）、P物质（C,D）和TRPV1（E,F）阳性神经元的平均百分比均显著低于野生型小鼠（G，*p<0.05）。数据以均值±标准误表示（n=3），采用t检验进行统计分析。

05.老年APP过表达CRND8小鼠从CFA诱导的炎性疼痛中恢复更快

通过足底注射CFA（25微升/爪）诱导炎性疼痛模型，发现3月和12月龄CRND8小鼠的基础热缩足潜伏期（PWL）均显著高于同龄野生型小鼠（图6A、7A，p<0.05）。注射CFA后4小时和24小时，两组小鼠的PWL均较生理盐水对照组显著降低（图6B-C、7B-C，p<0.05-0.01）。值得注意的是，12月龄CRND8小鼠在CFA注射后24小时的PWL仍显著高于同龄野生型小鼠（图7C，p<0.05）。至48小时，所有CFA注射组小鼠的PWL均恢复至生理盐水对照组水平（图6D、7D）。各时间点CRND8盐水对照组的PWL始终高于野生型对照组（图6B-D、7B-D，p<0.05-0.01）。

图6显示3月龄野生型与CRND8小鼠足底注射CFA诱导的炎性疼痛反应。Hargreaves测试显示：CRND8小鼠的基础缩足潜伏期（PWL）显著高于野生型小鼠（A，*p<0.05）。同样，CRND8盐水对照组小鼠的PWL在所有时间点均显著高于野生型盐水对照组（B-E，*p<0.05）。CFA注射后4小时和24小时，两组CFA注射小鼠的PWL均较各自盐水对照组显著降低（B-C，+p<0.05），但CFA注射组间无显著差异。至48小时，两组CFA注射小鼠的PWL与各自盐水对照组相比无显著差异（D）。数据以均值±标准误表示（n=7-8），采用单因素方差分析及多重比较检验。

图7显示12月龄野生型与CRND8小鼠足底注射CFA诱导的炎性疼痛反应。Hargreaves热痛测试结果表明：CRND8小鼠的基础缩足潜伏期（PWL）显著高于野生型小鼠（A，*p<0.05-0.01）。注射CFA后4小时，两组小鼠的PWL均较生理盐水对照组显著降低（B，+p<0.01），但组间无显著差异。注射后24小时，虽然CFA注射组小鼠PWL仍显著低于各自盐水对照组（C，+p<0.05-0.01），但CRND8组的PWL值显著高于野生型组（C，*p<0.05）。至48小时，两组CFA注射小鼠的PWL均恢复至盐水对照组水平，且组间无显著差异（D）。在所有检测时间点，CRND8盐水对照组的PWL始终显著高于野生型盐水对照组（B-D）。数据以均值±标准误表示（n=7-8），采用单因素方差分析及Student-Newman-Keuls多重比较检验。

四、讨论

本研究首次发现Aβ（17-24）多肽主要表达于背根神经节中小型神经元，这类神经元通常负责疼痛信号的产生与传导。CFA诱导的炎性疼痛模型中，同侧DRG的APP和Aβ多肽表达显著下调，提示其可能参与疼痛调控过程。在过表达APP的CRND8转基因小鼠中，不仅基础痛觉敏感性显著降低，且疼痛介质CGRP、SP和TRPV1在DRG中的表达同步下调，表明APP和Aβ多肽可能通过抑制疼痛介质的合成发挥镇痛作用。

特别值得注意的是，12月龄CRND8小鼠从CFA诱导的炎性疼痛中恢复速度显著快于同龄野生型小鼠，这可能与年龄相关的APP和Aβ多肽表达增加有关。随着年龄增长，CRND8小鼠神经组织中APP和Aβ多肽的积累逐渐增多，可能更强效地拮抗CFA对疼痛介质的上调作用。

临床观察显示阿尔茨海默病患者往往表现出疼痛敏感性降低，与本研究的发现高度吻合。虽然认知功能障碍可能影响疼痛感知，但本研究证实DRG疼痛介质的表达下调是CRND8小鼠痛觉迟钝的重要外周机制。这些发现为理解神经退行性疾病患者的疼痛感知改变提供了新的分子机制视角。

目前关于背根神经节中过表达的APP或Aβ多肽导致疼痛介质减少的具体机制尚不完全清楚。有研究表明，Aβ25-35能够抑制P物质诱导的皮肤血管舒张效应，这表明Aβ多肽可能通过抑制P物质的促炎作用来降低疼痛敏感性。另有研究显示，向大鼠脑部持续灌注Aβ多肽可降低皮层中P物质水平，阿尔茨海默病患者大脑皮层中含P物质的神经元也显著减少。本研究进一步证实，在过表达APP的CRND8小鼠背根神经节中，P物质表达同样降低。皮层神经元和初级痛觉神经元中P物质水平的整体降低，可能共同导致认知功能衰退和疼痛感知减弱。

除P物质、CGRP和TRPV1外，本研究还检测了小型非肽能神经元的疼痛标志物IB4，发现CRND8小鼠中IB4表达未发生显著改变。这表明APP和Aβ多肽对背根神经节疼痛介质的影响具有特异性，主要作用于肽能小型神经元。虽然阿尔茨海默病患者由于谷氨酸转运体和谷氨酰胺合成酶减少导致皮层和海马神经元中谷氨酸水平升高，但CRND8小鼠背根神经节中谷氨酸及其转运体是否发生变化仍有待研究，这为未来探索谷氨酸能系统在脊髓背角疼痛产生和传递中的作用提供了新方向。

综上所述，本研究首次发现APP源性Aβ多肽主要表达于大鼠中小型背根神经节神经元。外周炎症在上调P物质、CGRP和TRPV1等疼痛介质的同时，显著降低背根神经节中APP和Aβ的表达。另一方面，CRND8转基因小鼠内源性过表达的高水平APP和Aβ多肽抑制了背根神经节中P物质、CGRP和TRPV1的表达。行为学实验表明，年轻和年老CRND8小鼠的疼痛敏感性均降低，且这种降低随年龄增长而加剧，年老CRND8小鼠从炎性疼痛中恢复的速度快于野生型小鼠。

鉴于阿尔茨海默病患者常伴有不同程度的认知功能障碍和疼痛感知下降，其慢性疼痛状况更难以被诊断和充分治疗。本研究结论表明，APP和Aβ多肽可能通过减少背根神经节中疼痛介质的合成来发挥镇痛作用。虽然神经系统中的高水平Aβ多肽并非老年群体慢性疼痛高发的重要因素，但这一发现对阿尔茨海默病患者的临床护理具有重要启示：这些患者在认知功能衰退的同时，还伴有疼痛感知能力和组织保护性反射减弱，需要特别关注其疼痛管理问题。

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