可生物降解血管移植物的表面改性是改善组织工程血管移植物 (TEVG) 的原位内皮化和预防与当前合成移植物相关的主要并发症的重要策略。改善内皮化的重要策略包括通过 TEVG 的生物功能化来增加内皮细胞动员和增加内皮细胞捕获。本研究的目的是评估两种改善可生物降解聚酯血管移植物内皮化的生物功能化策略。这些技术包括将肝素交联到移植物表面以固定血管内皮生长因子 (VEGF) 或抗 CD34 抗体 (抗 CD34Ab)。为此，肝素、VEGF 和抗 CD34Ab 附着和定量测定证实了改性策略的有效性。将这些组的细胞附着和增殖与体外和体内未改性移植物进行了比较。为了评估体内移植功能，将移植物作为下腔静脉插入导管植入小鼠体内。根据显微镜技术、组织学结果和 eNOS 表达，改良的血管移植物在体内显示出内皮细胞附着和活性增加。改良移植物内腔直径也比对照组保持得更好。总体而言，虽然两种功能化移植物的表现都优于未改良的对照组，但与 VEGF 负载移植物相比，用抗 CD34Ab 改良的移植物似乎产生了最改善的结果。

一、引言

心血管疾病是全球死亡的主要原因。为了治疗许多与心血管疾病相关的疾病，通常使用自体血管或合成移植物。然而，自体血管可能受到现有疾病或先前手术的限制。在合成移植物中，并发症包括缺乏生长潜力、继发性移植物失败导致的钙化、感染易感性增加以及血栓栓塞事件和狭窄风险增加。组织工程血管移植物 (TEVG) 提供了一种克服这些并发症的潜在策略，它为自体细胞提供可生物降解的支架，使其附着、增殖并提供生理功能。一种能够促进健康血管组织生长并随时间降解的支架将消除许多与永久性合成移植物相关的并发症。然而，小直径 (<6 毫米) TEVG 失败的主要模式是由于新生内膜增生和血栓形成导致的移植物狭窄。因此，成功的 TEVG 必须防止血栓形成和内膜增生。由于血管内皮层对于维持血管稳态、预防内膜增生和血栓形成至关重要，因此建立一层能够充分覆盖 TEVG 内腔的内皮细胞 (EC) 单层对于移植的长期成功至关重要。快速建立这样的一层可以缓解目前与可生物降解血管移植物相关的挑战。

可以通过植入前的细胞接种和培养在 TEVG 上建立 EC 单层。植入前具有预培养内皮的移植物在体内表现良好，并显示出传统上与小直径血管移植物相关的并发症减少。然而，这些移植物的细胞接种可能耗时、昂贵且临床困难。

为了加速内皮化并消除与细胞接种相关的挑战，研究人员研究了各种原位内皮化策略。这些策略主要集中在植入后招募和促进 EC 和内皮祖细胞 (EPC) 在移植物内腔上的附着和增殖。EPC 在内皮化中的确切作用仍有争议，但早期和晚期 EPC 都对血管假体的体内内皮化有积极作用。早期 EPC 可能分泌血管生成细胞因子来支持其他 EPC 和 EC，而晚期 EPC 具有增殖和 EC 集落形成的潜力。虽然 EPC 的识别方法仍应标准化，但 EPC 的常见标记是 CD34。

为了充分利用 EC 和 EPC 的原位内皮化潜力，我们重点关注两种血管移植物改造策略：(1) 抗体固定和 (2) 生长因子加载。抗体固定策略主要用于改善细胞在移植物表面的附着，而血管内皮生长因子 (VEGF) 加载和随后的洗脱可能会诱导细胞动员进入血液以及从邻近组织迁移。已经研究了各种特定和非特定分子来诱导细胞捕获和附着。一种这样的生物功能分子，抗 CD34 抗体 (抗 CD34Ab)，已被用于通过增加 EC 和 EPC 的附着来诱导永久性血管支架的内皮化。包括这种抗体可能有助于邻近 EC 和 EPC 的募集和附着。然而，CD34+ 血管细胞只占循环中细胞的一小部分。

为了增加循环中可用的 EPC 数量，可能需要引入动员因子。例如，VEGF 可增加循环中 EPC 的比例。此外，结合的 VEGF 可影响 EPC 分化为成熟的 EC 样表型，同时增加 EC 的迁移和增殖。除了对 EPC 的影响外，VEGF 的扩散还可诱导成熟血管中的 EC 跨吻合部位迁移和增殖。VEGF 已通过利用肝素中存在的特定结合基序的支架成功递送。交联肝素还可保护结合蛋白的生物活性，从而可提高 VEGF 递送的功效。例如，与聚己内酯支架交联的肝素分子介导 VEGF 负载和扩散，从而成功促进血管生成增加，优于未改性的 PCL 支架。此外，肝素具有抗血栓特性，有助于最大限度地减少与小直径血管移植物植入相关的血栓形成，尤其是在局部剂量下。

我们试图通过评估两种涂层策略来加速和改善可生物降解的小直径血管移植物内皮化，这两种策略利用肝素交联表面来加载 VEGF 或固定抗 CD34Ab。通过利用这些生物分子，我们特别感兴趣的是研究哪种策略更有利于这些可生物降解的聚合物移植物内皮化。我们检查了 VEGF 的初始爆发释放或用抗 CD34Ab 修饰的表面是否会导致肝素交联血管移植物更有效、更有效地内皮化。通过检查细胞培养试验中的 HUVEC 和 EPC 附着和增殖以及体内小鼠模型来评估内皮化，表征和测试了改性移植物表面的效果。

二、材料和方法

2.1 移植物制造

制造方法利用了先前研究中描述和表征的溶剂铸造技术。简而言之，从 90:10 聚（乙醇酸-乳酸） (PGLA) 中切下 6.00 × 4.00 mm 切片用于体外试验，从聚（乙醇酸） (PGA) 聚合物 BIOFELT 中切下切片用于体内试验。将 PGLA 切片插入内腔直径为 1.4 mm 的聚丙烯管中，并将 21 g 不锈钢针插入管的另一端以保持移植物内腔的通畅。然后，将 1,4-二氧六环中 15% w/v 的 40:60 共聚物聚（己内酯-共-DL-乳酸） (PCLLA) 溶液放入聚丙烯管中以饱和 PGLA 或 PGA 毡。随后将移植物在 −20 ℃ 下冷冻 30 分钟，然后冷冻干燥 24 小时以消除多余的 1,4-二氧六环溶剂。完全干燥后，将移植物储存在 −20 ℃ 下直至使用。

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2.2 移植物改性程序

改性移植物利用肝素交联固定 VEGF 或抗 CD34Ab。我们评估了肝素交联表面上 VEGF 和抗 CD34Ab 的初始负载和保留。

2.2.1 肝素交联

肝素交联和定量改编自先前发表的方法。交联化学如图 1 所示。交联前，将支架浸入 0.05 M MES 缓冲液（pH = 5.55）中 15 分钟。随后将支架浸没在 MES 缓冲液中的 0.5 M 乙基-3-（3-（二甲氨基）丙基）-碳二亚胺）（EDC）、0.5 M N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和 1% w/v 肝素溶液中。孵育 14 小时后，用蒸馏水清洗支架以去除多余的副产物。

图 1. 移植物改性：EDC 化学反应用于肝素交联以及随后的 VEGF 和抗 CD34 抗体的负载和固定。

2.2.2 VEGF 加载

根据先前发表的方法，在 PBS 中制备浓度为 500 ng/mL 的 VEGF 无菌溶液。将支架在无菌条件下在室温下在 VEGF 溶液中孵育 1 小时。孵育后，将移植物在无菌过滤的 PBS 溶液中进行八次 5 分钟的清洗，以去除未结合的 VEGF。

2.2.3 抗 CD34 抗体固定化

对于抗 CD34Ab 涂层，将肝素交联移植物浸入 PBS 中 10 μg/mL 抗 CD34 一抗溶液中，在黑暗中 4 ℃ 下过夜。然后用 PBS 清洗移植物三次。

2.3 表面改性表征

2.3.1 扫描电子显微镜

通过扫描电子显微镜观察改性和未改性移植物的表面形貌。将移植物 (n = 5) 切成 1 mm 长的切片，用 2% 戊二醛固定，然后在乙醇中进行连续脱水。然后让样品干燥，随后安装并用碳溅射涂层，然后进行 SEM 检查。

2.3.2 甲苯胺蓝染色测定

通过甲苯胺蓝染色测定确认交联肝素。在 0.001 N 盐酸中用 0.02% (w/v) 氯化钠配制 0.0005% (w/v) 甲苯胺蓝氯化锌双盐溶液。将肝素交联和未改性支架在室温下在甲苯胺溶液中孵育过夜。支架表面的深紫色表明存在肝素，而未改性支架仍为白色。

2.3.3 VEGF ELISA

为了定量 VEGF 的附着和释放，根据制造商的说明使用人类 VEGF ELISA 试剂盒（Sigma）。简而言之，根据制造商的说明创建标准 VEGF 曲线，并将其添加到涂有捕获抗体（人类 VEGF-A）的 96 孔板中。将用于结合 VEGF 定量的样品放入 96 孔板的孔中，并作为结合底物与 200 μL 生物素化的抗人 VEGF 检测抗体（100 ng/mL）一起孵育。接下来，将 200 μL 链霉亲和素-辣根-过氧化物酶溶液添加到每个孔中，并将板在室温下孵育 45 分钟。随后，加入 100 μL 四甲基联苯胺 (TMB) 溶液，随后将板在室温下黑暗中孵育 30 分钟。通过添加 50 μL 2 N H2SO4“终止”溶液来终止反应。使用 SpectraMax M5 平板读数器在 450 nm 处测量所得溶液的光密度 (OD)，参考波长为 650 nm。根据标准曲线计算固定在支架上的 VEGF 值。对于 VEGF 释放，将结合 VEGF 的支架在 PBS 中在 37 ℃ 下孵育，以 65 rpm 的速度摇动。在 1、4、24 和 40 小时收集 PBS 并用新鲜 PBS 替换。使用先前描述的 ELISA 方法对释放到溶液中的 VEGF 进行量化。此外，通过将 VEGF 与移植物表面孵育来评估 VEGF 的非特异性结合，如所述，但不进行肝素交联。

2.3.4 抗 CD34 抗体荧光测定和 ELISA

为了确认抗体固定，将抗体修饰和未修饰的支架在室温下与 1% 牛血清白蛋白溶液一起孵育 30 分钟，以防止非特异性结合。然后用 PBS 清洗支架三次，并在 PBS 中加入 10 μg/mL 的与 FITC 结合的抗山羊 IgG 二抗。再次用 PBS 清洗支架三次。使用荧光显微镜可以观察到抗体固定成功。为了量化抗体附着，使用了山羊 IgG ELISA 试剂盒。该程序遵循制造商的说明，用抗 CD34 抗体代替试剂盒中包含的 IgG 标准。此外，通过将抗 CD34Ab 与移植物表面孵育来评估抗 CD34Ab 的非特异性结合，如所述，但不进行肝素交联。

2.4 体外粘附和增殖

体外细胞培养试验用于评估初始细胞附着和随时间推移的代谢活动，以评估抗 CD34Ab 和 VEGF 修饰移植物与 96 孔组织培养板中的对照之间的差异。

2.4.1 人脐带静脉内皮细胞 (HUVEC)

根据制造商的说明获取和培养 HUVEC。将移植物切割成适合 96 孔组织培养板的尺寸并放置在孔底。将具有抗 CD34Ab 固定、肝素化对照和未修饰对照移植物培养板的培养板在紫外线 (UV) 照射下灭菌 1 小时。用于 VEGF 修饰的移植物在加入无菌 VEGF 溶液之前要进行紫外线照射。细胞以 5 × 10^4 细胞/孔的密度接种在孔中，并在 37 ℃ 下孵育。为了测量细胞代谢活性，在初始细胞接种后 1.5 小时、1 天、3 天和 7 天进行 XTT 测定。在每个时间点，细胞还进行活/死染色并通过显微镜计数。细胞附着数定义为清洗后仍粘附在移植物表面的细胞总数。附着百分比是通过与接种在移植物上的总细胞数进行比较来计算的，该总细胞数被标准化为附着在单独的组织培养聚苯乙烯 (TCPS) 对照上的总细胞数。细胞群的倍数变化是通过将最终细胞群计数（第 7 天时间点）除以初始附着数（接种后 1.5 小时）来计算的。

2.4.2 内皮祖细胞 (EPC)

根据制造商的说明获取和培养人类 EPC。评估方法与 HUVEC 测定相同。

2.4.3 XTT 测定

根据制造商的方案进行 XTT 测定。总之，用 PBS 清洗 96 孔板的每个含细胞孔。加入总计 50 μL XTT 标记混合物以及 50 μL 培养基。将板在 37 ℃ 下孵育 4 小时。孵育后，将上清液转移到新板中。以 650 nm 为参考，在 450 nm 处测量上清液的吸光度。

2.4.4 实时聚合酶链反应

HUVEC 和 EPC 分别在六孔板中培养，培养物为未经改造、经肝素化、经 VEGF 或抗 CD34Ab（n = 3）的移植物。细胞接种密度为 3 × 10^5 细胞/孔，以确保有足够的 RNA 含量进行 PCR 分析。使用 RNeasy 试剂盒在第 1、3 和 7 天提取 RNA，与接种前立即从细胞样本中分离的初始 RNA 含量进行比较。使用 SYBR Green 一步法 RT-PCR 试剂盒（Qiagen）进行实时 PCR 分析。引物的参考编号为 eNOS（NM_000603）、VEGF（NM_001025366）和 GAPDH（NM_001256799）。使用比较阈值循环法分析结果，并使用 GAPDH 作为内源性参考进行标准化，并以相对值 (ΔΔCT) 报告为对照值。

2.5 体内植入

所有动物程序均经全国儿童医院机构动物护理和使用委员会批准。体内试验以我们之前进行的实验改编的方式进行。简而言之，使用显微外科技术将移植物（直径 1 毫米，长度 3 毫米）植入 6-8 周龄雌性小鼠体内作为下腔静脉 (IVC) 插入移植物。使用具有 VEGF-（n = 10）或抗 CD34Ab 修饰表面（n = 10）和未修饰表面（n = 10）的移植物。所有移植物在修饰后均在植入前进行紫外线照射以现场消毒。将小鼠麻醉并置于仰卧位，然后进行腹部中线切口。暴露下腔静脉，用十字夹钳夹住并切除。使用 10-0 尼龙缝合线将移植物植入近端和远端吻合口。小鼠从手术中恢复，并保持无抗血小板或抗凝治疗。

手术两周后，将小鼠麻醉并处死。切除后，将移植物固定在 4% 多聚甲醛中并嵌入石蜡中进行组织学检查或嵌入最佳切割温度 (OCT) 化合物中进行基因检测。然后用苏木精和伊红 (H&E) 染色剂对 5 微米厚的切片进行染色。用兔抗 CD31 鉴定内皮细胞。使用生物素化的二抗检测抗体结合，然后结合链霉亲和素-HRP。通过与 3,3-二氨基联苯胺 的显色反应进行显色。使用 ImageJ 软件根据周长测量计算移植物内径和外径。用苏木精对细胞核进行复染。使用 Leica CM 1950 低温恒温器将在 OTC 化合物中冷冻的移植物切成 20 个切片，每个切片 30 μm。通过在 PBS 中离心去除多余的 OCT 化合物。根据制造商的说明，使用 RNeasy mini 试剂盒 (Qiagen) 提取和纯化总 RNA。使用高容量 RNA-to-cDNA 试剂盒进行逆转录。用于基因表达分析的所有试剂和仪器均来自 Applied Biosystems。使用 TaqMan Universal PCR Master Mix Kit，使用 Step One Plus 实时 PCR 系统进行定量聚合酶链式反应 (qPCR)。引物的参考编号为 eNOS (Mm00435217_ml)、VEGF (Mm01281449_m1) 和 HPRT (HPRT；Mm00446968_m1)。使用比较阈值循环法分析结果，并使用 HPRT 作为内源性参考进行标准化，并以与对照值的相对值 (ΔΔCT) 报告。已观察到 NIH 实验室动物护理和使用指南 。

2.6 统计分析

使用方差分析单因素分析对数据进行分析，使用 Student t 检验或 ANOVA 假设数据分布为正态分布，置信度为 95% (p < 0.05)。每个图上都报告了标准偏差误差线以及相关的统计关系。

三、结果

3.1 固定化 CD34 抗体和 VEGF 的定量评估

由于纳米级表面特征会影响生物材料相互作用，因此通过 SEM 图像分析移植物的形态。图 2 显示了 VEGF 和抗 CD34Ab 修饰后的无细胞移植物表面。虽然实验组的表面特征看起来比对照移植物更粗糙，但每个修饰表面上的表面图案之间没有明显的可见差异。移植物表面的肝素化过程似乎在材料上引入了圆形颗粒结构。通过甲苯胺蓝测定确认肝素附着。通过二次 FITC-Ab 附着和 ELISA 确认抗 CD34Ab 附着。还使用 ELISA 确认 VEGF 附着成功。

图 2. 改性前后的移植物表面：显示对照 (A−C)、抗 CD34Ab 改性 (C−E)、VEGF 改性 (F−H) 和仅肝素 (I−K)。比例尺分别代表 100 μm (A、C、F、I)、40 μm (B、D、G、J) 和 10 μm (C、E、H、K)。

首先分析VEGF的负载效率，ELISA结果表明VEGF修饰产生了3.08±0.33％的VEGF负载效率。抗CD34Ab的负载效率为23.57±0.62％。VEGF从肝素交联的TEVG表面的洗脱率可以在图 3 中看到。在24小时内，28.0±2.9％的VEGF残留在VEGF修饰的表面上。24小时后的抗CD34Ab保留显示99.3±0.20％的抗体残留在抗CD34Ab修饰的表面上。还确定了生物功能分子的非特异性吸附。在孵育未经肝素/EDC交联的生物功能分子并随后彻底清洗后，仅1.56±0.47％的抗体仍被吸附。相比之下，发现总 VEGF 的 34.08 ± 16.64% 被非特异性吸附。

图 3. 移植物表面生物分子的持久性：(A) VEGF 和 (B) 抗 CD34Ab 在不同时间点残留在 TEVG 上的初始负载分子百分比。移植物在 37 ℃ 的 PBS 中孵育，轻轻摇晃以研究前 48 小时内负载生物功能分子的爆发释放。

3.2 EC 和 EPC 对改性 TEVG 表面的反应

HUVEC 和 EPC 的总代谢活性结果如图 4 所示。抗 CD34Ab 修饰的移植物在第 3 天显示出总 HUVEC 代谢活性比对照移植物有统计学显著增加，尽管抗 CD34Ab 修饰的移植物和 VEGF 修饰的移植物之间没有差异 (p < 0.05)。否则，在 7 天内，在改性和未改性移植物上，HUVEC 群体的总代谢活性之间没有明显差异。对于总 EPC 代谢活性，在初始细胞接种后的第 0 天和第 1 天，抗 CD34Ab 修饰的移植物均比未改性对照和 VEGF 修饰的 TEVG 表面有所增加。在第 7 天，与对照组相比，只有 VEGF 修饰的移植物显示出总 EPC 代谢活性的显著增加，尽管 VEGF 和抗 CD34Ab 修饰的移植物之间没有差异。仅使用肝素和未修饰的对照组之间的附着细胞总代谢活性没有差异，除了在第 3 天，仅使用肝素的移植物的总 HUVEC 代谢活性与未修饰的对照组相比有所降低。

图 4. 对仅含肝素、VEGF 和抗 CD34 修饰移植物的总代谢反应。（顶部）通过 XTT 培养基的相对吸光度测量 HUVEC 代谢活性。（底部）通过 XTT 培养基的相对吸光度测量 EPC 代谢活性。请注意，n = 4；* 表示与该时间点内所有其他组相比具有统计学意义，# 表示与该时间点未修饰对照相比具有统计学意义，& 表示与该时间点仅含肝素对照相比具有统计学意义（p < 0.05）。

抗 CD34Ab 涂层移植物显示出比对照组和 VEGF 修饰移植物更高的初始 HUVEC 和 EPC 附着。在第 1 天，VEGF 和抗 CD34Ab 修饰的移植物都显示出比未修饰对照组更多的 HUVEC 群体。在第 3 天，抗 CD34Ab 移植物上的 EPC 细胞数量多于对照组。此外，在第 7 天，抗 CD34Ab 修饰表面的 EPC 数量比 VEGF 修饰和未修饰的对照移植物都要多。仅使用肝素的对照与对照相比没有差异，除了第 1 天附着的 HUVEC 数量减少。图 5 显示了所有活/死计数结果。表 1 总结了细胞在各种移植物表面的初始附着情况，表 2 显示了 7 天后附着在细胞移植物上的总细胞群的增殖情况。

图 5. 仅含肝素、VEGF 和抗 CD34 修饰移植物上的细胞附着和增殖。（顶部）通过活/死计数的 HUVEC 群体。（底部）通过活/死计数的 HUVEC 群体。请注意，n = 4；* 表示与该时间点内所有其他组相比具有统计学意义，% 表示与该时间点的仅使用肝素和未修饰的对照相比具有统计学意义（p < 0.05）。

表 1. 以组织培养聚苯乙烯为标准的移植物表面上细胞的初始附着百分比 a

a * 表示与对照移植物表面相比具有统计学意义（p < 0.05）。

表 2. 7 天内细胞的倍数变化。

根据 PCR 结果，如图 6 所示，与其他组相比，附着在抗 CD34Ab 移植物上的 HUVEC 在第 1 天表达的 eNOS 基因 mRNA 倍数变化增加。在第 3 天，与其他移植物相比，VEGF 修饰移植物上的 HUVEC 的 VEGF 基因表达倍数变化增加最显著，而 eNOS 基因表达显着降低。此外，在第 3 天，与 VEGF 修饰和未修饰的移植物相比，仅使用肝素和抗 CD34Ab 的移植物均显示出附着的 EPC 的 VEGF 表达的倍数变化更高。附着在抗 CD34Ab 移植物上的 EPC 在第 3 天也显示出明显更高的 eNOS 表达。第 7 天，移植物表面之间没有显著差异。

图 6. 仅使用肝素、VEGF 和抗 CD34 修饰的移植物上细胞的 mRNA 表达。（顶部）HUVEC 的 VEGF（左）和 eNOS（右）的 mRNA 表达。（底部）EPC 的 VEGF（左）和 eNOS（右）的 mRNA 表达。请注意 n = 3；* 表示与该时间点内所有其他组相比具有统计学意义，表示与该时间点的 VEGF 和未修改对照相比具有统计学意义，% 表示与该时间点的仅肝素和未修改对照相比具有统计学意义（p < 0.05）。

3.3 修饰移植物体内评估

植入两周后，所有修饰移植物均显示出比对照移植物更大的内腔直径。图 7 中可以看到取回的移植物管腔横截面示例。总体而言，与未修饰移植物和 VEGF 修饰移植物相比，用抗 CD34Ab 修饰的移植物在植入两周后内腔直径更大。与对照相比，VEGF 和抗 CD34Ab 修饰的移植物均保留了更大的内径。与未修饰的对照移植物相比，抗 CD34Ab 修饰的移植物还表现出更大的外径。此外，与 VEGF 修饰和未修饰的移植物相比，抗体修饰的移植物保持较小的壁厚。壁厚比较见表 3。同样，移植的抗 CD34Ab 修饰移植物 qPCR 分析显示 eNOS 基因表达明显高于对照。与移植的对照移植物样品相比，VEGF 移植物在 eNOS 表达方面没有显著差异。比较这三组时，VEGF 基因表达水平没有显著差异。结果总结并比较在图 8 中。CD31 染色（内皮细胞标记）显示修饰移植物中形成了内皮，如图 9 所示。内皮形成在用抗 CD34Ab 修饰的移植物中尤为突出。

图 7. 植入后 TEVG 的横截面：(A) 对照、(B) VEGF 和 (C) 抗 CD34Ab。这些代表性横截面显示了植入两周后对照 (A) 与修改移植物 (B、C) 相比直径减小的明显差异，以及移植物内的组织和细胞外基质形成。比例尺代表 500 μm。

表 3. 两周后小鼠体内植入的移植物壁厚近似值a

a * 表示与对照移植物表面相比具有统计学意义（p < 0.05）。

图 8. TEVG 的生化和物理分析。（左）移植样本的相对 eNOS 表达。与移植对照组相比，抗 CD34Ab 移植物导致移植组织中的 eNOS 表达增加。（右）植入两周后移植物内腔和外腔直径。与未改良对照组相比，VEGF 和抗 CD34Ab 移植物保持了统计学上显著更大的内径。（底部）比较四组改良和未改良的血管移植物，VEGF 表达没有统计学上显著的差异。请注意 n = 10；* 表示与所有其他组相比具有统计学意义，# 表示与对照组相比具有统计学意义（p < 0.05）。

图 9. TEGV 的内皮细胞染色。在小鼠模型中，植入两周后，(A) 未修饰移植物和 (B) VEGF 和 (C) 抗 CD34Ab 修饰移植物中内皮形成和 CD31 表达区域的图像（箭头所示）中 CD31 染色呈深棕色。抗 CD34Ab 显示出更均匀的 CD31 染色。比例尺代表 20 μm。

四、讨论

本研究的目的是对比两种旨在提高血管移植物内皮化程度的策略。具体来说，我们试图确定从移植物表面或固定的抗 CD34 抗体中突然释放 VEGF 是否会导致内皮化程度增强。

通过量化与移植物结合的 VEGF 和抗 CD34 抗体，我们能够确定这些分子在我们的可生物降解移植物上的负载效率和随时间保留。我们发现 VEGF 经历了爆发式释放曲线，这与以前的研究预期一致。此外，根据这些研究，预计 VEGF 负载低于抗 CD34Ab 负载。由于肝素呈现的结合位点的特定方向和呈现，VEGF 的高度特异性肝素结合域可能会限制负载。由于 VEGF 的这些肝素结合域，我们研究中交联肝素分子中 VEGF 的洗脱率与其他研究中观察到的洗脱率相似。与 VEGF 洗脱相反，抗 CD34Ab 浓度随时间变化不大，非特异性吸附最小，几乎所有结合抗体均保留，表明抗体更永久地固定在移植物表面。在类似的研究中也观察到了这种趋势，这些研究假设抗体可能由于 EDC 化学反应后的氨解而共价连接，或者可能经历强烈的蛋白质-蛋白质相互作用（例如范德华力、氢键、亲水相互作用、静电相互作用等）。VEGF 立即洗脱的另一个原因是非特异性结合的 VEGF 百分比与抗 CD34 抗体相比更大（34.08 ± 16.64% vs 1.56 ± 0.47%）。

通过我们的体外研究，我们发现移植物的修改产生了微尺度移植物地形的明显变化。这种地形粗糙度可能会影响细胞附着，如先前的研究表明。然而，为了证明肝素化（以及由此产生的粗糙度增加）是否会导致细胞附着力比未修饰的对照增加，我们评估了附着在移植物上的细胞群。未添加 VEGF 或抗 CD34Ab 的肝素化移植物与未修饰的对照移植物相比，在细胞附着方面没有差异。附着在此类移植物上的细胞的总代谢活性与对照移植物也没有区别。事实上，1 天后，附着的 HUVEC 总数少于未修饰移植物上的 HUVEC，3 天后，与对照相比，HUVEC 的总代谢活性降低。相反，与未修饰的对照相比，附着在此类移植物上的 HUVEC 表达的 eNOS 基因水平增加，附着在这些移植物上的 EPC 在第 3 天表达的 VEGF 水平增加。最终，这些移植物上的细胞增殖似乎与未修饰的对照没有区别。

我们之前的研究表明，这里修改的小直径 TEVG 具有与天然血管相似的机械性能，可以成功植入小鼠模型。先前的研究还表明，两周足以预测血管重塑并证明是否会发生内膜增生。使用两周的时间点来确定急性内皮化反应，我们修改了可生物降解的聚酯移植物并将其植入小鼠体内。虽然体内移植组织中形成的 VEGF 表达在各组之间没有统计学差异，但功能化移植物显示出更大的内腔直径。两周内腔直径的保留是降低狭窄风险的重要指标。功能化移植物还通过表达 CD31 表现出内皮细胞活性。内皮细胞标记物 CD31 在两个生物功能化移植物组中都很明显，CD31 染色显示移植物内腔的内皮细胞覆盖率良好。然而，与对照移植物相比，只有抗 CD34Ab 修饰移植物表现出更高的 eNOS 表达。抗 CD34Ab 移植物还表现出更好的减小壁厚的保留效果。这些结果可能与体外观察结果有关，即抗 CD34Ab 移植物表现出明显更高的 HUVEC 和 EPC 附着率。更高的初始细胞附着率可能导致更早形成健康的内皮，从而导致壁增厚和再狭窄减少，同时在体内环境中保持内腔直径。有趣的是，至少在这个实验设计中，修饰移植物的效果在体外仅比对照移植物具有短暂或暂时的优势。最一致的结果是细胞最初附着在抗体修饰的移植物上。结合抗 CD34Ab 移植物在体内的表现，可能进一步支持以下观点：加速细胞附着可能是改善原位内皮化的最重要因素之一。

低至 10 ng/mL 的 VEGF 浓度即可影响 EC 迁移和增殖。鉴于培养基体积小（200 μL）且 96 孔板孔的表面积相对较大（0.3165 cm²），根据 ELISA 结果，该阈值在体外很容易达到。可生物降解移植物上的 VEGF 负载密度近似为 12.92 ± 2.42 ng/cm²，随后确保体外 VEGF 浓度大于 10 ng/mL。一旦植入，VEGF 的爆发性释放可能仅提供急性益处，与抗 CD34Ab 移植物相比，内皮化明显减少。尽管如此，与未修饰的对照移植物相比，在 VEGF 修饰移植物上形成的组织确实表现出增加的 CD31 表达。根据其他研究，这种影响可能是由于从邻近组织招募和动员 EC 所致。事实上，先前的研究表明，未改良的植入移植物内皮化主要是由于 EC 在吻合部位的迁移。因此，VEGF 可能在局部起作用，增加从邻近组织招募 EC 以增加未改良移植物内皮化，而不是提供任何系统性 EPC 动员。

抗 CD34 抗体已被证明是一种有效的招募工具，可增加 EC 和 EPC 附着力，尤其是在永久支架上。虽然全血循环中还有其他 CD34+ 细胞，但先前的研究表明，抗 CD34 抗体有效地诱导了 CD34+ EPC 的附着，其附着率明显高于 CD34+ 造血干细胞群，这显然是由于抗原呈递率较高。我们的研究结果支持了抗 CD34 抗体募集在内皮样细胞附着于移植物基质以及随后的内皮功能方面的有效性。这种内皮形成和功能可能导致抗体修饰移植物壁厚变薄，这可能表明再狭窄风险降低。结合本文介绍的结果，用抗 CD34 抗体修饰可生物降解的肝素交联血管移植物（无论是否含有其他生物功能分子）可能是一种有希望的策略，可以加速和增加移植物表面内皮化。

总体而言，改良的移植物显示出内腔直径保持良好和 eNOS 表达的趋势，这对于血管稳态至关重要，可作为健康内皮功能的指标。通过对移植物内腔内 CD31 表达的染色，进一步证实了健康的内皮形成，尤其是在用抗 CD34 抗体改良的移植物中。

五、结论

本研究的目的是确定可生物降解血管移植物的功能化是否可以改善整体移植物内皮化并随后减少植入后的狭窄。可生物降解聚酯血管移植物通过独特的肝素交联策略进行功能化，以固定抗 CD34Ab 或 VEGF。尽管体外数据仅支持内皮活性或细胞附着的短暂增加，但经过修饰的移植物表面在体内可引起更好的内皮和内皮样细胞附着。看来，用抗 CD34Ab 修饰的肝素交联可生物降解聚合物移植物略优于 VEGF 修饰的移植物，并明显优于对照移植物。修饰的移植物促进了新组织的形成，而没有血栓形成或狭窄等重大并发症。经过修饰的可生物降解血管移植物的性能似乎有望改善组织工程中合成血管移植物原位内皮化。

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